MS31A位点MVR-PCR技术在法医学鉴定中的应用

一tl8pJournalofForensicMedicine，February．2000，Vol16No．1MS31A位点MVR—PCR技术在法医学鉴定中的应用!生专丝(辽宁省刑事科学技术研究所，辽宁沈阳¨0D32)，亍．f摘要】应用小卫星特异性引物3lA、3lA—A、31A—G与d一PdCTP掺八扩增技术对MS3IA(位于D7S21位点)进行MVR—PCR分析，成功地建立了一套适合于刑事案件中微量血痕、混合斑、毛发、骨组织等样品鉴定的快速、简便、准确的分析技术。灵敏度分析表明，该方法能检测出低至1ng的基因组DNA，具有较高的灵敏性。本技术在40奈起强奸、凶杀等疑难案件中应用均获得成功。拳研究还利用MVR数据库资料对实际案件中的犯罪嫌疑人成功地进行了筛选、排查以及串并棠I作，一．f关键词】：墨墨丛塑!il=曼堡堡型l西碜『中图分类号】DF795．2’[文献标识鹤】A[文章编号]1004—5619(2000)01—0018—03小卫星DNA变异重复制图(minisatellitevariantrepeat曲)技术简称MVR—PCR．是9O年代初期出现的一种新型DNA分析技术，具有高灵敏度、高识别能力，尤其适合法医学中DNA多态性分析的需要。因此，这种技术一经出现，便受到法医界众多学者的充分重视。本研究选取了多态性好的小卫星MS31A进行MVR—PCR技术应用研究工作，总结如下。1材料与方法1．1材料30份血痕、35份混合斑样品、l5份毛发(带毛根)样品及同一个体的8种不同组织样品均为实际案件检材；5份骨组织样品为自然环境条件下放置1～3年的实际案件检材。1．2DNA模版的提取与制备12．1血痕、肌肉等检材DNA提取对血痕、肌肉、心、肝、脾、肺、肾、脑等检材均采用蛋白酶K消化，用酚一氯仿有机溶剂法提取DNA，详见文献I1]。12．2混合斑中精虫DNA提取用蛋白酶K两步消化，酚一氯仿法，详见文献[21。1．2．3毛发DNA提取见文献[3】。1．2．4骨组织DNA提取采用常规酚一氯仿有机溶剂法。1．3MS3IA位点的MVR—PCR扩增13．1MS3IAMVR—PCR分析引物的选择与合成MS3lA位于D7S21位点上，D7S21位点定位于7P22一pter，包括MS31A和MS31B两个小卫星，二者间隔15bp，存在两个相邻的碱基替换多态性，从5’端为G／A与C／T，其中C／T变化更具有多态性。本研究根据C／T变化设计引物进行研究。引物序列：3lA引物：5’CCC几-rCCACCCTCGACGCTCCCc3’3lA—A引物：5’ACTCT(GrGCCACCCCA3’3IA—G引物：5’ACTCT(GICCACCTCCC3’1．3．2MS31A的MVR—PCR反应(a一PdCTP直接掺八扩增法)反应体积为25t-d，设置两个反应体系(A和T)：反应液中含2OWmol／LMk、2．5t．d10×bufier、02mmol／LdNTP、56．5~g／mlBSA、201xmol／L3lAl物，DNA模板1—100rig、1．25UTaq酶(PE公司)、a一PdCTP5uCi。在A反应体系中再加人20pmlol／L3lA—A引物；在T反应体系中加入20p．mol／L3lA—c引物液体石蜡覆盖，置于PE一2400型DNA扩增仪运行如下程序：94'：C预变性3mira94℃变性1min、68'C退火lmin、7d℃延伸2．5min，25个循环，最后70％延伸lOroAn。1．4扩增产物电泳分离及放射自显影扩增产物采用中性聚丙烯酰胺凝胶(T7％，C2％)电泳分离，分离后凝胶经干燥用x光片压片进行放射自显影8～12h，即可得MVR图谱。1．5MVR图谱判读方法根据MVR—PCR图谱上A、T二条泳道中不同重复单位位置处谱带的有或无及先后顺序按如下规定进行人工判读、编码：(1)一A泳道有带，一T泳道无带，为1型，编码为1，用数字⋯1’和“0”表示为(1，0)，；(2)一A泳道无带，一T泳道有带，为2型，编码为2，用数字⋯0’和⋯1’表示为(0，1)；(3)一A泳道有带，一T泳道有带．为3型，编码为3，用数字“1”和“1”表示为(1．1)；{4)一A泳道无带，一T泳道无带，为4型，编码为4．用数字“0和“0”表示为(O，O)。本编码方法与文献报导的小卫星DNAMVR分析的编码方法相似，只是不考虑谱带的强弱变化，从而避免了结果判读的主观性“。尽管这种编码方法减少了一定的信息量，但对MVR的个体识别能力没有大的影响，而且分析结果更客观、准确。维普资讯http://www.cqvip.com法医学杂志2000年2月第16卷第1期2结果与讨论2．1微量及不同时间血痕样品的MVR—PCR分析对3O份于室温干燥条件下保存1—10年不等的血痕纱布剪取lcm长的纱线进行检测