应用MVR—PCR和毛细管电泳分析D1S8位点的结构多态性

呲黼蔷川．s．21(5)7应用分析MVR—PCR和毛细管电泳D1S8位点的结构多态性①法医学教研室张百帆沈安乡●_●_一畔属湘雅医院中心实验室贺明伟、_‘-—-‘__一’61提要应用MVR—PCR扩增10名无血缘关系个体的DNA样末，扩增产物用毛细管电泳分离异用激光诱发薨光(LIF)检剥。结果显示每一个体可检出6～14个扩增片段，个体闻呈明显差异。谊方Kit_合法物检验中分析微量或蘸关键词DNA，卫星；多聚酶链反应；电泳；位于人类1号染色体长臂(1q42～43)的D1S8基因座位(MS32克隆)是由长度为29bp的重复单位构成的小卫星DNA。可串联重复19次上，其等位基因平均长200个重复单位。。。1990年Jeffreys等对MS32克隆的DNA序列分析表明，7O的重复单位有一个A—G的碱基转换，导致产生一个HaeⅢ限切酶位点，因而使重复单位分为HaeⅡ和HaeⅢ两种类型。前者称n一型，后者称t一型。作者参考Jeffreys的方法“，采用三个引物扩增t^型重复单位，扩增产物用毛细管电泳分离并用激光诱发荧光(LIF)方法检测。，初步揭示了其结构多态性的特点。1材料与方法1．1小卫星变异重复单位聚合酶链反应(Minisate[1lteVariantRepeatPCR，MVR—PCR)原理在MVRPCR方法中(图1)，引物32TAGT是自HaeⅢ切点起与t一型重复单位互补的寡核苷酸链又接上一段不能与模板互补的TAG顺序：引物TAG只能与扩增产物链中与TAG互补的顺序退火；而引物32一OR刚与紧靠小卫星DNA侧翼序刑退火。当32TAG—T、32—0R及TAG井用时．PCR产物刚为一系列始于32，OR井MR—f)c代Is1童、激光诱发荧光方法L工F终止于t一型重复单位的长度梯度片段，其长度反映了t一型重复单位在小卫星DNA中的排列位置。1．2样末与试荆①lo名无血缘关系的个体选自血库献血员。采外周静脉血，用酚，氯仿抽提法提纯外周血自细胞DN,a~，经紫外分光光度计定量后稀释为20～40ng·I～②三种引物由Cetlmark公司提供：序列为：320R：5GAGTAGTTTGGTGGGAAGGGTGGT3‘：32一TAG—T：5。TCATGCGTCCATGGTCCGGACATTCTGAGTCACCCCTGGT3。{TAG：5TCAT—GcGTccATGGTccGGA。@IlF药盒(BeckmanCorp．产品)1．3扩增反应总体积281的反应体系中含32一TAG—T20nmol·L，32—0R1Ⅱlt)I．L一，4种dNTP(PromegaCorp)各lmmo[·L～，Tris·HCI(pH8．8)45mmo[-L．硫酸铵IImmo[·L～．MgC1z45mmol·L～．2一MercaptoethanoI6．7mmol·L一．EDTA(pH8．0)4．4~*molL。。，BSAII3,ug·mI～，模板DNA100～200ng。置DNA扩增『义(TC480型)中，97C10min后在8oC加入2．5UDNA聚台酶(PromegaCorp．)．接着95Clmin20s，65Clm[n．71C3rain，循环30次；I．‘扩增产物的分离与检测取6I扩增产物置高效毛细管电泳仪(BeckmanCorp．500P,／ACESystem)中．7000V电压进样10S，在25℃柱温及9000V电压下电泳35min分离扩增产物。毛细管有效长度50cm，1996—03-20收犒．①湖南省科委资助课题(OI一942—89I2)维普资讯http://www.cqvip.com应IⅡMVR【rRlIt口管电泳丹析1)1翳位点的结构多志性氍帆等320Ram~try一plus一TAG)1wl-n口一1)I●示t·重复单位：口示a型重复单位；-示与引物TAG互朴的l顿序I}}I、,Iii～、t～、一J“,jjlli,’固1MVR—PCR原理图示【D低浓度引物32TAGI。鲆～个小1J星骨于中的t一型重复单位退止．并延曲至小卫星侧翼}蓬l与T』、卫星侧翼退火的引物32一()R产生的序列带有一十与TAG互补的顺序l@用高浓度的32一OR和TAG进一步扩增Fig1①Atlowcnncemrat~n0primer．32一TAG—TwillafI|healt0ahouronel-typerepeatunitpertargetmlnisate]]itemoleculeandextendintotheflankingDNA④Amp[imer32．ORprimesfromtheflankingDNA．crea~ingasequencewithendcomplementary1oTAG⑨AmpllfyeffKientlyusinghigheonceatratloa0[32一()Rand