铜绿假单胞菌YY24的异养硝化—好氧反硝化功能基因的研究

第37卷第4期第37卷第4期水产科学Vol.37.37No.4.42018年7月2018年7月FISHERIESSCIENCEJul.2018.2018DOI：10.16378/j.cnki.1003-1111.2018.04.007铜绿假单胞菌YY24的异养硝化一好氧反硝化功能基因的研究刘兴1，李连星1，薄香兰1，陈继楚1，周胜杰1，王军2，王立红3，陈成勋1(1.天津农学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384;2.天津立达海水资源开发有限公司，天津300280;3.鼎正动物药业(天津)有限公司，天津市饲用微生物制剂企业重点实验室，天津300383)摘要：为研究铜绿假单胞菌YY24硝化、反硝化功能基因及催化过程，分别对关键酶基因（&1!1〇八、1^-卩八、1^1'0、11丨1'1^、11^'3、〇1〇出、911〇出、11〇32、11丨1:1^)进行？0^扩增、鉴定及测序，通过琼脂糖凝胶电泳确定目的基因片段。研究结果表明，amoA基因为铜绿假单胞菌YY24硝化关键酶氨单加氧酶的编码基因；铜绿假单胞菌YY24存在膜结合硝酸盐还原酶;亚硝酸还原酶的类型为细胞色素cdl型亚硝酸盐还原酶nirS;铜绿假单胞菌YY24存在一氧化氮还原酶norB，能够将NO催化转化为N20,其基因类型为qnorB;铜绿假单胞菌YY24中存在nosZ基因。关键词:硝化;反硝化;功能基因;铜绿假单胞菌中图分类号：S917.1文献标识码：A文章编号：1003-1111(2018)04-0475-09近年来，诸多关于异养硝化一好氧反硝化菌研究已见报道，但其研究重点仍然聚焦在可行性分析运用上的宏观脱氮效果，针对异养硝化一好氧反硝化分子机制，即微观方面的研究却依然鲜见。异养硝化菌在脱氮过程中是通过硝化过程和反硝化过程两个步骤完成的，每个过程都有不同的酶参与。硝化过程主要由氨单加氧酶和羟胺氧化酶参与[1];反硝化过程中主要由硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶发挥效应[2]。铜绿假单胞菌（)YY24是在天津立达海水资源开发有限公司海水养殖池筛选获得的脱氮高效细菌，研究结果表明，该菌在最佳生长条件下的氨氮去除率可达99.06%，脱氮率达到97.27%[3]。笔者以铜绿假单胞菌YY24为研究对象，就铜绿假单胞菌YY24的9种硝化反硝化基因进行PCR扩增、鉴定及测序，从分子水平对铜绿假单胞菌YY24的异养硝化一好氧反硝化分子机制进行研究。1材料与方法1.1菌种及培养基铜绿假单胞菌YY24保存于本实验室，已测出的16SrDNA部分基因序列长度为1428bp(NR_037000.1)[3]。YY24用30%甘油保存于一80°C冰箱中，使用时提前1d活化培养。异养硝化培养基:NH4C10.5g/L;柠檬酸钠5.66g/L;维氏盐溶液50mL;调节pH到7.0。维氏盐溶液：K2HP045.0g/L;MgS04•7H202.5g/L；FeS04•7H200.05g/L；MnS04•4H200•05g/L;盐度为15的海水(NaCl15)。所有培养基于121°C灭菌15min，待培养基冷却至室温再使用。1.2主要仪器与试剂1.2.1主要仪器Eppendorf梯度PCR仪（Mastercycle公司），SN-NJ0601电泳凝胶成像分析系统(北京信诺莱伯仪器有限公司），DYCP-44N快速凝胶电泳仪(北京市六一仪器厂），SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），FA21041/1000电子天平(天收稿日期：2017-04-17;修回日期：2017-10-23.收稿日期：2017-04-17;修回日期：2017-10-23.基金项目：国家自然科学基金(面上)资助项目（31270456);天津市水产产业技术体系创新团队项目（基金项目：国家自然科学基金(面上)资助项目（31270456);天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017001);天津市科2017001);天津市科技支撑计划重大项目（12技支撑计划重大项目（12ZCDZNC05900);天津市应用基础与前沿技术研究计划（重点项目）（1305900);天津市应用基础与前沿技术研究计划（重点项目）（13JCZDJC29200);天津市29200);天津市教委一般项目（20140626).教委一般项目（20140626).作者简介：刘兴(1993—），男，硕士研究生;研究方向:养殖水环境.作者简介：刘兴(1993—），男，硕士研究生;研究方向:养殖水环境.E-mail:454737714@:454737714@qq..com.通讯作者:陈成勋（1967—），男，研.通讯作者:陈成勋（1967—），男，研究员，硕士生导师;研究方向:水产养殖.究员，硕士生导师;研究方向:水产养