石油烃厌氧降解基因masD和bamA实时荧光定量PCR方法的建立及应用

DOI:10.19756/j.issn.0253鄄3820.181417石油烃厌氧降解基因masD和bamA实时荧光定量PCR方法的建立及应用宋本如1摇甄梅楠1摇刘小妹1摇唐景春*1,2,3(1南开大学环境科学与工程学院,2环境污染过程与基准教育部重点实验室,3天津城市环境诊断与污染修复工程中心,天津300071)摘摇要摇masD和bamA基因分别是烷烃和芳烃厌氧降解的关键基因。本研究建立了这两种基因的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法。通过参考相关石油烃厌氧降解菌株的GenBank序列,利用Primerexpress软件设计烷烃和芳烃厌氧降解基因的扩增引物masD鄄f、masD鄄r和bamA鄄f、bamA鄄r。经过常规PCR扩增分别得到片段大小为389和354bp扩增产物,经测序并在NCBI数据库查询,确定为masD和bamA片段。通过实时荧光定量PCR构建测定这两种基因的标准曲线。优化后的扩增体系(25滋L)为:12.5滋L2伊TransStartTopGreenqPCRSuperMix,引物浓度为0.2滋mol/L,masD和bamA基因最适退火温度分别为52益和56益。建立的两种基因的实时荧光定量PCR检测方法具有非常好的重复性,其灵敏度比传统PCR技术高100倍。对于氧化石墨烯促进石油烃的厌氧降解体系中厌氧基因的定量检测显示,添加不同浓度的石墨烯均促进了bamA拷贝数的增加,但对masD的拷贝数无显著影响。关键词摇石油烃;厌氧降解基因;masD基因;bamA基因;实时荧光定量聚合酶链式反应摇2018鄄06鄄22收稿;2018鄄12鄄05接受本文系国家自然科学基金项目(Nos.41473070,U1806216)、天津市科技计划项目(Nos.16YFXTSF00520,17ZXSTSF00050,17PTGCCX00240)、CNPC科技发展计划(No.2016D鄄4610)和高等学校学科创新引智计划(111计划)(No.T2017002)资助*E鄄mail:tangjch@nankai.edu.cn1摇引言随着石油工业迅速发展,石油烃在土壤和水体中的污染已成为普遍的环境问题[1]。好氧生物修复被认为是修复石油烃污染的有效方法。然而,在许多被污染环境(如沉积物和地下水)中,通过提供氧气刺激微生物的生长非常困难,而且成本高昂[2]。大量研究表明,石油烃在缺氧或厌氧的环境下同样可以被兼性菌和厌氧菌降解[3],这一新观点对于石油污染土壤、地下水及沉积物环境的原位生物修复,特别是针对一些分散的面源污染及工程修复条件较差的石油污染环境具有重要的意义。超过半数的石油污染的主要成分是烷烃[4]。在(1鄄甲基烷基)琥珀酸合酶(mas)催化下的富马酸加成反应是大多数厌氧降解菌活化烷烃降解的关键步骤[5,6]。芳烃是石油污染中的重要成分,也是最常见的地下水土污染物。在厌氧环境中,大多数芳香族碳氢化合物(如苯系物、多环芳烃等)都经过微生物作用,形成中间体6鄄十六氧环烯基鄄CoA。该中间体开环反应的关键酶是由bamA基因编码的6鄄十六氧环鄄1鄄烯鄄1鄄羰基CoA水解酶[7,8],且bamA基因在可降解芳香烃污染物的厌氧微生物中广泛存在。因此,将编码这两种关键酶的bamA基因和催化亚基masD基因作为遗传标记,为研究石油烃降解菌在厌氧环境中的分布特征和降解潜力提供了一种方法。实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime鄄qPCR)是20世纪90年代中期逐渐发展起来的技术,它可以对目的基因进行定量检测,是一种快速高效、准确灵敏、方便易操作的检测方法[9,10]。SYBRGreenI作为一种实时定量PCR的荧光染料,在游离状态下不发出荧光,与单链DNA基本不结合,但可与DNA双链非特异性结合,并发出荧光,具有通用性好、成本低等优点[11,12]。然而,目前实时定量PCR方法在石油烃厌氧降解方面的应用还很少[13]。氧化石墨烯具有丰富的官能团和较高的比表面积,可以在厌氧条件下被许多微生物部分还原,可促进电子转移[14]。所有这些特征都有助于催化厌氧微生物对污染物的降解[15]。据报道,氧化石墨烯和部分还原的氧化石墨烯可促进难降解污染物的生物和非生物降解,如偶氮染料、硝基芳族化合物和卤化污染物[16,17]。但也有文献指出,氧化石墨烯能够吸附并破坏微生物的细胞壁,从而抑制微生物的生长[18]。因此,研究厌氧条件下氧化石墨烯对石油烃生物降解的影响具有重要意义。第47卷2019年2月摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇分析化学(FENXIHUAXUE)摇研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第2期207~213本研究利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR技术建立了一种检测石油污染厌氧环境中