A型肉毒毒素重链在大肠杆菌中的厌氧表达

doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2019.06.004研究报告A型肉毒毒素重链在大肠杆菌中的厌氧表达韦娜，付楚溪，汪建华，熊向华，张惟材军事科学院军事医学研究院生物工程研究所，北京100071［摘要］目的：用大肠杆菌表达可溶性A型肉毒毒素（BoNT/A）重链。方法：按大肠杆菌偏好密码子设计合成重链N端（HN）编码序列，重叠延伸PCR连接HN和重链C端（HC）构成重链基因；将重链基因构建至pTIG-TrxA载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），厌氧培养与好氧培养分别诱导表达重链；SDS-PAGE比较表达条带，ELISA比较不同表达条件的重链表达水平。结果：测序结果表明正确设计合成了HN编码序列；SDS-PAGE结果显示重链厌氧表达条带的相对分子质量与预期一致，好氧表达条带的相对分子质量比预期小；定性ELISA结果显示静置培养表达的重链活性远远高于摇床培养。结论：BoNT/A重链在大肠杆菌中厌氧条件下表达活性明显高于好氧表达，为厌氧生物蛋白在大肠杆菌中的表达提供了新思路。［关键词］A型肉毒毒素；重链；大肠杆菌；厌氧条件［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2019）06-0751-05AnerobicExpressionofBoNT/AHeavyChaininE.coliWEINa,FUChu-Xi,WANGJian-Hua,XIONGXiang-Hua*,ZHANGWei-Cai*BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100071,China*Co-correspondingauthors,XIONGXiang-Hua,E-mail:xiongxianghua@sina.com;ZHANGWei-Cai,E-mail:ammsmelab@126.com［Abstract］Objective:ToexpressbotulinumneurotoxinserotypeA（BoNT/A）heavychain（HC）inE.coli.Methods:CodingsequenceforHCNwasdesignedasE.colicodonusagepreference,ligatedwithwhichforHCCbyoverlapextensionPCR.TheHCgenewasconstructedintopTIG-TrxA.pTIG-TrxA-HCwastransformedintoE.coliBL21（DE3）.HCwasexpressedinaerobicoranerobiccondition.ExpressionandactivityofHCindifferentconditionswerecomparedbySDS-PAGEandELISA.Results:DNAsequencingdemonstratedthatHCNcodingsequencewasrightlysynthesized.SDS-PAGEshowedthatHCinanerobicconditionwasexpressedasexpected,andactivityofHCexpressedinanerobicconditionismuchhigherthanwhichinaerobiccondition.Conclusion:BoNT/A-HCwasexpressedanerobiclyinE.coli,whichprovidedanewmethodforexpressinganerobiosisproteininE.coli.［Keywords］botulinumneurotoxinserotypeA（BoNT/A）;heavychain;E.coli;anerobiccondition肉毒毒素（botulinumneurotoxins，BoNTs）是一类由肉毒梭菌产生的神经毒素，为已知毒性最强的细菌毒素，通过阻碍神经-肌肉突触传递引起松弛性麻痹发挥毒性作用。BoNTs包括A~G共7种血清型，其中BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F能够引起人类肉毒中毒[1-2]。BoNTs的合成包括以下步骤：首先，肉毒梭菌合成相对分子质量（Mr）为150000的单链前体蛋白，随后在细菌自身内源蛋白酶的作用下，毒素前体被切割为Mr为100000的重链（HC）和50000的轻链（LC），二者收稿日期：2019-09-25基金项目：国家科技重大专项（2018X09J18105-003）作者简介：韦娜（1982-），女，博士，（E-mail）nanavv@126.com通信作者：熊向华，（E-mail）xiongxianghua@sina.com；张惟材，（E-mai