利用dsDNA层层膜检测芬顿试剂对天然DNA的损伤

第33卷第8期2012年8月通化师范学院学报JOURNALOFTONGHUANORMALUNIVERSITYVo1．33№8Aug．2012利用dsDNA层层膜检测芬顿试剂对天然DNA的损伤廖天录，刘军(甘肃工业职业技术学院化工学院，甘肃天水74025)摘要：凭借聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)和带负电荷的DNA存在的相互之间的静电作用交替吸附在玻碳电极表面，进而形成非常有序的{dsDNA／PEI}层层膜．采用槲皮素作为电活性指示剂来检测芬顿试剂对天然dsDNA的损伤．由于槲皮素在DNA多层膜中具有的非常特别的可逆吸入模式，这中模式能够明显分辨损伤和未损伤DNA多层膜的吸入量．由此检测芬顿反应引起的DNA的氧化性损伤，可以提供一种新的检测DNA损伤的电化学方法．关键词：dsDNA层层膜；芬顿试剂；槲皮素；DNA损伤中图分类号：Q523文献标志码：A文章编号：1008—7974(2012)o8—0021—02基金项目：2011年甘肃省天水市市级财政专项资金项目；甘肃工业职业技术学院基金项目(Gzy2011—17)．收稿日期：2011—10—23作者简介：廖天录(1974一)，甘肃天水人，硕士，甘肃工业职业技术学院化工学院讲师．DNA是生物遗传信息的基本载体．一般它的分子结构不会在活动过程中改变，然而，生物体内外部的一些物理和化学因素很有可能使得它的分子结构发生异常变化，这就称为是DNA的损伤⋯．所以，研究DNA损伤的检测具有重大意义，它对于新化合物的毒性筛选、生物污染物的检控以及生态毒性学研究具有现实意义．电化学方法是检测DNA损伤的一种新的可选择的检测手段』，它具有简单、快速、灵敏、价格低等诸多优点．过氧化氢与催化剂Fe“构成的氧化体系通常称为芬顿试剂．芬顿反应产生羟基自由基对DNA的损伤已得到证实．本文中，采用槲皮素作为电活性指示剂与dsDNA的嵌人作用来检测芬顿试剂对天然DNA的损伤．1实验部分1．1试剂聚乙烯亚胺(PEI，Mw一1800)购于AlfaAesar公司；小牛胸腺DNA(北京华美生物工程公司)；双氧水(HO：，质量分数30％)购于天津市化学试剂公司；硫酸亚铁(FeSO)购于与成都临江化工厂；槲皮素购于中国科学院兰州化物所；其它所用试剂均是分析纯，水是于4~C条件下储存的二次蒸馏水．在每次试验前均需用高纯度氮气除去氧气．除了DNA损伤的实验外所有实验都是在室温(20±2)cC下进行的．本实验所用的0．1mol／L醋酸盐缓冲溶液(pH=5．0)均需进行CV测试．1．2仪器CHI832电化学工作站(美国)上完成，Branson200超声清洗仪(美国)；pHS一3C型酸度计(上海)；石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B，上海亚太技术玻璃公司)，玻碳电极的直径是3．5ram．1．3实验过程(1)先用0．1m和0．05lzm的抛光粉对玻碳电极分别进行抛光，之后将抛光好的玻碳电极放到超声清洗器里使用准备好的丙酮和二次水分别进行5分钟的清洗，接下来再用氮气将其吹干．之后再将该电极交替分别浸入到聚乙烯亚胺和dsDNA中各l0分钟，直至他们能够交替吸附到电极表面，这中间还需用二次水冲洗，此时会形成一层膜它就是{dsDNA／PEI}膜．然后依据设计好的膜层数再对上述实验过程操作2次，最后可以获得多层膜{dsDNA／PEI}，．(2)室温下在5mL电解池中进行循环伏安实验．工作电极为裸玻碳电极、DNA修饰电极或DNA与槲皮素产物的修饰电极．铂电极为对电极，Ag／AgCl(饱和KC1)为参比电极．(3)槲皮素吸人上面的多层膜是通过将该膜电极浸泡在1×10mol／L槲皮素缓冲溶液(pH=5．0，含0．1MNaC1)里，不断搅拌至少2小时直到达到吸入平衡或稳定状态．此时吸入槲皮素量最多状态的膜就被指定为{dsDNA／PEI}，一Qc膜，然后利用醋酸缓冲液对该膜进行清洗并用氮气吹干，之后将它放入到醋酸缓冲液中进行CV扫描．在此状态的DPV氧化峰电流就被定为，n．之后把该状态的该膜在醋酸缓冲液中进行浸泡一夜，使Qc从膜中最大限度的释放出来，而且还需不间断的把该膜放人醋酸缓冲溶液中进行cv扫描．而针对DNA损伤实验，我们需要把充分吸附了槲皮素的该膜放入到缓冲液中1小时使尽可能多的在膜中非特殊键合槲皮素释放出来．然后将该膜放人到含硫酸亚铁(1．5mmol／L)和双氧水(0．5mol／L)的醋酸盐缓冲溶液中，并在37~C下搅拌一段时间对DNA的损伤．为了除去DNA膜上吸附的芬顿试剂与非特殊键合槲皮素，再把损伤的该膜放入到缓冲溶液中浸泡1小时．之后将损伤的该膜放人醋酸缓冲液中CV扫描，此时CV氧化峰电流指定为．而且每次检测对上述过程至少重复3次，DNA损伤实验都在暗室中进行．2结果和讨论’把充分吸附了槲皮素的{dsDNA／PEI}一Qc膜先浸泡到缓冲