血红蛋白纯化中不同微滤系统的比较

2019年第7期吉林畜牧兽医11·实验研究·ShiYanYanJiu血红蛋白纯化中不同微滤系统的比较尚殿明，董玉影，何焱长春市中保牧生物科技有限公司，吉林长春130507摘要：为了筛选出一种适用于规模化生产高纯度血红蛋白的微滤设备，本实验采用自制血红蛋白，经过三种不同的微滤设备进行纯化，比较纯化后血红蛋白的纯度，以及不同微滤系统的回收率、耐压性和工作效率。结果表明：卷膜微滤系统纯化的血红蛋白纯度为99.98%，高于中空纤维微滤系统和颇尔微滤系统。并且卷膜微滤系统的耐压性最好，最大耐受压为5bar，工作效率最高为可达3.8L/min，回收率90.3%，可以有效节约生产成本。关键词：微滤系统；纯化效果；性能人工血液代用品临床应用前景广阔[1，2]，因此对人工血液代用品的研究热度只增不减。血液代用品其本身没有毒性，无红细胞表面抗原决定簇，无需交叉配型，更不用进行相容性检验，因此优势明显。但是如果血液代用品的纯度不够，混有红细胞的氨基磷酸酯和内毒素等杂质，则会发生一定的毒性反应，Bayliss[3]早在1920年就报道，当去除红细胞膜时，毒性反应基本观察不到。由此可见，血红蛋白的纯度严重影响到血液代用品的安全性，在血液代用品生产的过程中必须重视分离纯化工艺，而如何优质、高效、低成本地实现血红蛋白的规模化分离纯化对血液代用品生产企业而言意义重大。在此过程中血球的清洗、溶血的时间、低渗液的选择、滴加速度及微滤系统都是非常重要的环节，本文主要论述企业在规模化生产过程中微滤系统的选择及其优点。1材料与方法1.1材料牛血红蛋白,自制：选用新鲜鲁西黄牛无菌静脉血，经过五步离心、清洗后得到的牛红血球，然后再经过滴加低渗液并搅拌得到的含有细胞碎片的牛血红蛋白。1.2微滤设备①卷膜微滤系统：中国，吉林海普科技发展有限公司；②中空纤维微滤系统：中国，吉林柏盛生物科技有限公司；③颇尔微滤系统：德国，PallCorporation。1.3实验设计本公司自制蛋白含量为49.56g/L的牛血红蛋白各70L，同一组人分别用三种微滤系统切向流过滤牛血红蛋白，记录开始时间、结束时间、进液压力、回液压力及微滤结束时间和微滤后血红蛋白的体积。然后测定微滤后血红蛋白的纯度及浓度，并根据记录数据计算回收率和工作效率。1.4纯度的测定以0.15mol/L氯化钠-0.05mol/L磷酸盐缓冲液作为流动相，以1mL/min的流速平衡检测系统，至检测器基线平稳。取经0.45μm膜过滤的牛血红蛋白标准品溶液（5mg/mL）和供试品溶液（5mg/mL）各5μL注入高效液相色谱仪，检测波长280nm，检测时间30min，进行系统适用性试验，标准品溶液和供试品溶液色谱图中血红蛋白的保留时间应一致。然后取待测样品适量，用流动相稀释至4mg/mL，用漩涡混合器混匀，经0.22μm膜过滤，取5μL注入液相色谱仪，检测时间30min，检测波长416nm，记录色谱图，用归一化法计算样品的纯度。1.5回收率回收率（%）=溶血后血红蛋白总量/微滤后血红蛋白总量×100%1.6工作效率工作效率（L/min）=(溶血后血红蛋白体积（L）)/(微滤时间（min）)作者简介：尚殿明（1974-），男，本科，中级，研究方向：兽药生产。122019年第7期吉林畜牧兽医·实验研究·ShiYanYanJiu2结果2.1微滤后血红蛋白纯度提取后的血红蛋白，多采用膜分离、离子层析、色谱法等进行进一步纯化[4～7]，从图1中可以看出，卷膜微滤系统的纯化效果最好，微滤后血红蛋白的纯度可达99.98%，其他两种微滤系统的纯化效果次之。A：卷膜微滤系统；B：中空纤维微滤系统；C：颇尔微滤系统图1微滤后血红蛋白的纯度2.2三种微滤系统性能的比较本公司在实验阶段，也尝试过常规过滤，但滤膜很快堵塞，没有应用价值，因此借鉴目前在动物细胞连续培养时经常采用的切向流过滤技术。该过滤方式下，液体的流动方向是平行于膜表面的，切向流体会产生垂直于滤膜的压力，推动溶质和小分子通过滤膜，进而完成过滤，因此，也被称为“错流过滤”（CrossFlowFiltration）。而常规过滤中压力推动液体，直接穿过滤膜进入下游，大的颗粒或分子被截留在膜的上游或内部，小的颗粒或分子透过膜进入下游，也有人称之为“死端过滤”（DeadEndFiltration）。与常规的过滤相比，切向流在过滤过程中对膜的表面进行不停的“冲刷”，冲刷去除其上截留的分子，从而使滤膜表面的积垢程度降至最低，有效的缓解了大的颗粒和分子在膜上的堆积。本公司在规模化生产初期也尝试过常规过滤，但因其过滤性能差，所以没有采用。在切向流过滤中，压差，跨膜压，切向流速这几个参数关系密切。跨膜压（TMP）是指滤膜上下游的平均压力差，是控制液体过滤的速度的；压差是进口端压力与出口端压力的差值。压差决定切向流速和