实时荧光定量PCR在污水处理活性污泥中的应用

第32卷第1期苏州科技大学学报(工程技术版）Vol.32No.12019^3MJournalofSuzhouUniversityofScienceandTechnology(EngineeringandTechnology)Mar.2019实时荧光定量PCR在污水处理活性污泥中的应用倪敏'章豪2,刘婷婷u，潘杨w(1.苏州科技大学江苏省环境科学与工程重点实验室，江苏苏州215009;2.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏苏州215009)摘要摘要：活性污泥微生物脱氮除磷工艺是一种新型洁净、经济节约的废水处理方法，具有广泛的应用前景。目前绝大多数微生物尚未实现纯培养，传统的微生物学分析方法对优势菌种的物种丰度和功能基因的研究受到很多局限。实时荧光定量PCR技术的出现弥补了传统微生物研究方法的不足，为环境样品活性污泥微生物的菌种数量和功能基因的研究提供了新的途径。重点回顾了环境活性污泥样品的特点，介绍了qPCR在环境活性污泥污水处理领域的应用，以及该方法的优缺点。对全面认识qPCR检测活性污泥微生物的种类和数量，解析微生物污水处理工艺的微生物学机理、指导工艺的稳定运行具有重要意义。关键词关键词：实时荧光定量PCR;污水处理;活性污泥;绝对定量中图分类号：中图分类号：Q89;X703.1文献标识码：文献标识码：A文章编号：文章编号：2096-3270(2019)01-0010-05实时焚光定量PCR(ReaI-timeFlurescentQuantitivePolymeraseChainReaction,qPCR)技术于1995年由美国PE公司推出，HeicF等首先就其原理及方法进行了报道。该技术的推行实现了对环境微生物菌种及功能基因进行定性和绝对定量的检测，打破了传统微生物纯培养困难、亲缘关系较近菌种无法区分鉴别、各进化分支菌种分类研究止步不前等瓶颈，特异性强、灵敏度高、操作简便无毒害，目前已在动植物基因工程121、微生、医学领域[4]和环境领域H中得到广泛应用。活性污泥法作为一种新型的微生物污水处理技术，在城市污水处理中应用广泛。处理过程主要依靠生物量丰富的微生物聚集体—“菌胶团”,分解污水中的有机物，并不断进行新陈代谢，达到连续处理废水的目的气相比于物理和化学处理技术，基于微生物代谢作用的活性污泥法具有处理效果好、工程造价相对较低、运行成本低廉等优点^。污水处理过程中微生物优势菌种群落结构的变化及丰度与工艺的稳定运行密切相关。qPCR应用于检测活性污泥微生物的目标基因，反映微生物的群落结构或功能。qPCR对微生物的准确定量和定性有助于解析污水处理的过程及机制，对反应工艺的稳定运行提供指导。1环境活性污泥样品的特点环境活性污泥样品是指在环境水处理领域中,使用生物法进行脱氮除磷处理所驯化产生的具有功能微生物的污泥，具有以下特点：（1)样品来源多样，有城市生活污水处理厂底泥、垃圾处理堆渗滤液、工业废水处理厂、河道底泥、湖泊底泥等;qPCR通用的细菌引物可以针对不同来源的样品，检测相同的菌种，为不同来源样品菌种种类和丰富度的比较提供可能。（2)成分复杂，微生物种类丰富，原生动物、后生动物、古菌、原核生物、真核生物并存;qPCR应用于微生物种类的定性和定量研究需建立在能设计特异性引物的前提下，特异性引物的设计提高了检测的针对性,避免了纯菌检测的复杂性。（3)杂质多样，后续分析干扰因素较多，腐[收稿日期][收稿日期]2018-04-02[基金项目][基金项目]国家自然科学基金项目（51778390);江苏省自然科学基金项目（BK20171219);苏州科技大学科研基金项目(XKZ2017001)[作者简介][作者简介]倪敏（1989-)，女，安徽阜阳人，硕士，实验师，主要从事微生物脱氮除磷理论及工艺研究，Email:nimin@mail.usts.edu.cn〇第1期倪敏，等:实时荧光定量PCR在污水处理活性污泥中的应用11殖酸、蛋白质、糖类、酚类、重金属等各种有机物无机物混合，同时含有各种酶类,其中核酸酶对基因组的抽提产生较大的干扰,如核糖核酸酶会降解RNA,对RNA的抽提得率产生抑制'腐殖酸在基因组中的残留，容易抑制酶的活性,从而对qPCR的扩增产生抑制，影响检测结果的准确性P'qPCR前处理过程的基因组抽提和纯化在基因组浓度和质量方面有统一的要求,标准的操作过程减少了样品杂质的异质性对实验结果准确性的影响。（4)环境活性污泥样品的分析主要集中于原核生物的分析,对特定菌种和特定基因的定性和定量主要通过制备浓度已知的标准品进行实时荧光定量PCR—绝对定量,绝对定量灵敏、准确、认可度高，但对操作环境、人员素质的要求较高;qPCR绝对定量弥补了相对定量及常规的分子生物学方法在微生物数量统计方面的不足。（5)原核生物16SrDNA有11个恒