假单胞菌O—2—2利用油脂废水生产鼠李糖脂研究

70中国油脂2005年第30卷第10期文章编号：1003—7969(2005)10—0070—05中图分类号：TQ647文献标识码：A假单胞菌0—2—2利用油脂废水生产鼠李糖脂研究梁生康，王修林(中国海洋大学化学4~cx_学院，266003山东省青岛市)摘要：通过摇瓶培养试验，研究了铜绿假单胞菌0．2。2以植物油精炼废水为原料生产鼠李糖脂生物表面活性剂的适宜条件。结果表明：以NaNO3为氮源，碳氮比为15，培养基初始pH为7．5，32℃，250r／min培养84h，鼠李糖脂产量最高，达2．14g／L。液一质联用分析结果表明，所提取的糖脂由11种同系物组成，都含有1～2分子的鼠李糖和1～2个含口一羟基的碳链长度为8～12的饱和或不饱和脂肪酸。该糖脂生物表面活性剂的临界胶束浓度为69．5mg／L，可将水的表面张力降至29．2mN／m，具有良好的耐温耐盐性。关键词：生物表面活性剂；鼠李糖脂；铜绿假单胞菌0．2．2；植物油精炼废水；培养条件；理化性质鼠李糖脂是目前研究较多的一种生物表面活性剂，它不仅具有可与化学表面活性剂相媲美的增溶、乳化、润湿、发泡等性能，而且具有低毒、易于生物降解、对环境友好等特性，因而在石油开采、医药、食品、日化、环保等领域具有很大的应用潜力E1。目前，限制鼠李糖脂在工业上广泛应用的主要因素是其过高的生产成本，而寻找价格低廉、来源广泛的原料作为微生物发酵生产鼠李糖脂的培养基，可有效降低其生产成本E。在植物油的精炼过程中会产生大量有机废水，这类废水的特点是有机物和油脂含量高，但不含重金属和其他有毒物质E，可作为微生物发酵生产鼠李糖脂的原料。本文通过摇瓶培养实验，探讨了铜绿假单胞菌(edomonasae／7／~／／／,osa)0—2—2以植物油精炼厂废水为主要原料发酵生产鼠李糖脂的适宜培养条件；同时利用液相色谱一电喷雾质谱联用仪(HPLC．ESI—MS)分析了该糖脂的化学结构特征，并研究了其主要理化性质。1材料与方法1．1油脂废水油脂废水取自青岛嘉里植物油有限公司精炼车间炼油废水，废水水质测定依国标进行。1．2菌种、培养基与培养条件铜绿假单胞菌(P．ae／7／~／／／,osa)0—22由本实验室分离自胜利油田孤岛采油厂长期被原油污染的土壤，4℃保存于营养琼脂斜面并定期转接。种子培养基包括(L)：葡萄糖，10；KH2PO4，2．0；K2HPO4，4．0；NaNO3，4．0；NaC1，1．0；Mgso4·7H20，收稿日期：2005—01—04基金项目：国家“十五”科技攻关项目(2002BA904B06)；青岛市科技发展计划项目(2004—2一JZ一108)作者简介：梁生康(1972一)，男，博士；主要从事石油污染生物处理和微生物提高原油采收率方面的研究。通讯联系人：王修林教授／博士生导师0．2；pH为7．0。发酵培养基是将油脂废水用4层纱布过滤后添加适量氮源，调pH为7．0。培养时，从琼脂斜面上接种到30mL种子培养基中，30℃，200r／min摇床培养12h后，按2％的接种量接人含500mL发酵培养基的2000mL三角瓶中，30℃，200r／min摇床培养。1．3鼠李糖脂的提取及化学组分分析糖脂的提取参照文献[4]的方法，即发酵液于8000r／min离心除去菌体，上清液用6mol／L的盐酸调pH为2．0，等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水Na2S04干燥，40℃减压蒸馏，所得到的黄色油状物为糖脂粗产物；2．0g粗产物溶于0．05mol／L的NaHC03溶液，过滤后，再用盐酸调pH为2．0，4℃下放置24h。离心收集沉淀，溶于5mL的乙腈：水为5：5(V／V)混合溶剂中，离心并过滤后用于鼠李糖脂的化学组分分析。分析仪器为美国Agilent公司HP1100型高效液相色谱一电喷雾质谱联用仪，配以AlhimaC18反相键合(150rain×4．6mIn×0．5tin1)色谱柱。进样量：20，分流进样(1：4)；流动相：乙腈一水，采用线性梯度洗脱，10％乙腈保持3min，然后在3～33min内由10％乙腈线性升到90％乙腈，并保持30rnjn；流速：1mL／min。质谱条件：采用负离子电离；雾化气和干燥气都为；碰撞电压：一70V；喷雾电压：3．8kV；离子源温度：120℃；脱溶温度：300℃；柱后流出物导人离子源速率：5L／min；质谱扫描质量数范围：200～1000m／z。各组分质量分数的确定采用面积归一化法。1．4测定方法菌细胞生物量以菌体干重表示。糖脂含量的测定参照文献[5]的方法。油脂含量以非分散红外光谱法测定。硝酸盐含量以酚二磺酸一分光光度法测定。表面张力以吊环法于30℃下测定，所用仪器为美国CSC科学仪器公司NOS．70545型表／界面张力仪。乳化能力测定参照文献[6]的方法，即带刻度试管中加入10mL测试