嗜盐菌碱性淀粉酶特性研究

第3O卷第2期西安交通大学学报V。1．30N921996年2月JOURNALOFXI'ANJIAOTONGUNIVERSITYFeb．1996嗜盐菌碱性淀粉酶特性研究詹谷宇党永————————一、—————一(化学工程学院)丁&6P，、摘要‘’1碱·tt．嗜盐菌HalobacteriumspH一371产生的淀粉酶经超滤、硫酸铵沉淀和DEAE一纤维素纯化后，SDS—PAGE凝胶电泳为一条带，分子量为2．7万，等电点3．7，最适反应pH9．0，最适反应温度65C．NaCI是维持酶活性的必需因子，酶解产物为麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖．关键词；塞堕粪差堡茎塑嗜盐杆菌中国图书资料分类法分类号：TQ64．8-'-0引言麦芽低聚糖类已逐渐受到医药、食品、保健品等行业的重视，因它有延长供能、加强耐力、恢复疲劳、克服脑功能紊乱等功效．本文报道一株嗜盐菌产生的碱性淀粉酶及其水解淀粉生成麦芽低聚糖的初步研究结果．1材料与方法1．1菌株与培菌HalobacteriumspH一371由盐碱土中分离获得．于500ml三角瓶装5Oml培养液．每升培养液含酵母膏10g．水解酪素氨基酸(casaminoacid)7．5g，KCI2g．Na2CO318．5g，MgSO{、7H￡O1g，可溶性淀粉10g．NaC1200g，pill0～10．5．110c灭菌10rain，其中NaC1与NaCO二者合并后单独灭菌．接入与上述培养基成分相同的琼脂斜面培养物l环，于37℃，200r／rain摇床培养24h为种子液．取5m1种子液接入装有100ml上述培养液的500ml三角瓶振荡培养48h，10kg离心除菌体，上清液为粗酶液．1．2酶的纯化跟踪测定酶活过排阻为4万和l万的超滤膜去除杂质及浓缩，酶活部分缓慢加入硫酸铵使成8O饱和度．冰箱过夜，9kg离心30rain，弃上清液，沉淀溶于少量100mmol／LpH9收到日期：1994—12-14．詹各宇：男，1937年1月生，生物工程研究所．教授维普资讯http://www.cqvip.com-第2期詹各宇等嗜盐菌碱性淀粉酶特性研究甘氨酸氢氧化钠缓冲液，并对上述缓冲液透析脱盐，上DEAE22纤维索柱，用NaCI梯度洗脱，合并高酶活部分．1．3酶活测定含1可溶性淀粉10NaCI，I100mmo|／LpH9的甘氨酸氢氧化钠缓冲液4501，加酶液50I，40℃反应10rain，加DNS试剂1mI，沸水褡5rain，冰沿2min，加水4．5ml，于500nm测OD值，并换算为葡萄糖．1酶活单位相当于上述条件下每分钟形成1pmol麦芽糖的量．酶的pH稳定性测定是预先将酶置入欲测定pH缓冲液50C30min，再按常规测定酶活，酶的温度稳定性测定是将酶预先置于不同温度下保温30rain，然后按常规测酶活．1．4等电点测定按文献I-3]用聚丙烯酰胺凝胶薄层等电点聚焦法，先用pH3．5-i0Ampholine测出等电点范围，然后用Ampholine2．5-4测定，将电泳后的凝胶带精密切割浸出两性电懈质，用精密pH计测得其相应酶蛋白位置的等电点．1．5蛋白质含量lowry法用牛血清白蛋白为标准，或测280nm吸光度A．1．6分子量测定按文献[5，6]聚丙烯酰胺凝胶浓度10，交联度2．6，染色剂为考马斯亮兰R一250．淀粉酶活性染色按文献[7，8]，电泳完毕将凝胶切成两半，其中一半考马斯亮兰染色显带，另一半使酶蛋白原位复性后，覆盖在含0．2可溶性淀粉的琼脂板上，置40℃温箱保温1h，然后再用碘蒸汽显示出淀粉酶活性带．I．7酶解及产物分析含1可溶性淀粉10NaCI，i00mmol／LpH9的甘氨酸氯氧化钠缓冲液1，加酶液0．1ml(约3单位纯化酶)，42℃反应60h，沸水浴1rain，7kg离心5rain，取上清液，循环用Dowex一50氢型阳树脂和AmberliteIRC44氢氧型阴树脂反复脱盐后过滤，按文献FC上高压液相色谱和行薄层层析．I．8主要材料与试剂DEAE一纤维索22为Whatman公司产品．标准分子量蛋白为BioRadLab产品，麦芽三糖至麦芽七糖为日本SSC(株)产品，Ampholine，丙烯酰胺及甲叉二丙烯酰胺为Sigma产品，其它试剂均为分析纯等级．表1H一371淀粉酶的纯化2结果与讨论2．IH一371淀粉酶的纯化HalobactetiumspH一371淀粉酶各步纯化结果列于表1．图1为DEAE一纤维索纯化H一371维普资讯http://www.cqvip.com西安交通大学学报第3O卷淀粉酶的洗脱曲线．纯化后的酶经凝胶电泳显示一条带、淀粉酶活性染色证明，这条带就是H371淀粉酶(图2)、080160管缸柱{1cmX413cmI流速：40mJ／h1分部体积：4m[／臂|··淀粉醇I——蛋白质r氯化钠图1H一371酶的DEA