_苯系化合物好氧降解菌的驯化和筛选

第17卷第6期1699年12月环境科学ENVIR()NMENTALCSIENCEVol.17,No.6I:沁e.,1996苯系化合物好氧降解菌的驯化和筛选`陆军王菊思赵丽辉贾智萍陈梅雪(中国科学院生态环境研究中心,北京1。。。8幻摘要为了筛选降解苯系化合物的优势菌种,选用城市污水处理场和石化废水处理场的活性污泥作为菌源,分别以甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、1,3,5一三甲苯作为底物.在好氧条件下,驯化、筛选和分离出了能以上述6种化合物作为生长的唯一碳源和能源的微生物25株,并对其进行了初步的鉴定.这些菌株的好氧生物降解研究结果表明,它们对苯系化合物具有良好生物降解能力.关镇词菌株筛选,苯系化合物,好氧生物降解.目前,生物降解有机物的研究多是在厌氧条件下进行〔,一6〕,好氧条件下的生物降解研究较少.本研究从城市污水处理厂和石油化工废水处理厂2种活性污泥中驯化、筛选和分离到能以甲苯、乙苯、苯胺、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯和1,3,5一三甲苯作为生长唯一碳源和能源的微生物;检验了这些菌株对上述化合物的好氧生物降解能力,为苯系化合物生物降解机理与代谢途径的研究提供了优势菌株.1材料与方法Ll菌源的来源和培养分别从城市污水处理厂和石油化工废水处理厂曝气池中取活性污泥,曝气24h后,用超声波振荡(10min)均匀,接种于新鲜的液体培养基中.选用的培养基是唯一碳源培养基.培养基(1):2.09/IJ(NH;)25();,0.59/I才KHZPO;,0.59/LNaHP();,0.39/I一MgSO4,0.29/L酵母膏;培养基(2):5.0ml/L磷酸盐缓冲液(21.759/LKZHpO;·HZO,33.49/LNaZHPO;·12H2O,8.59/LKHZP()4,5.09/LNH;CI),3.0ml/LMgSO;水溶液(22.59/IJ),1.0ml/LCaC12水溶液(36.49/L),1.0ml/LFeCI。水溶液(0.259/L),1.0微量元素溶液(39.9mg/LMnSO;·HZO,42.8mg/LZnSO4·HZO,34.7mg/IJ(NH;)6Mn:02;·4HZO).2种培养基的pH值均为7.0.培养基接种前均高压蒸汽灭菌.分别选用甲苯、乙苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、1,3,5一三甲苯作为微生物生长的唯一碳源和能源.LZ菌种驯化和筛选菌种的驯化和筛选分3组(编号分别为I、l和皿),其中第l组和第I组采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法;第l组采用定时定量补充浓度相对较低的化合物的驯化方法.3组均为好氧振荡培养,温度为28C,每个驯化周期结束时,将培养物移接至新鲜培养基中,并观察其生长情况.移种数次以后,分别以无菌操作平板划线分离,每个样瓶划两个平板,置培养箱(28C)中培养一段时间之后,挑取单一菌落接种于牛肉膏斜面上,继续培养一段时间后,于冰箱(4C)保存.驯化、筛选实验条件如表l所示.L3菌种的观察与鉴别观察记录菌种的生长状况、菌落特征、菌体的形态结构及运动形式.对各菌株进行革兰氏染色与芽饱染色.L4生物降解实验(1)培养基配制和培养条件活化富集培,国家自然科学基金委员会资助项目收稿日期:1996一03一29DOI:10.13227/j.hjkx.1996.06.001环境科学17卷表l驯化和筛选实验条件组别化合物名称培养基类型驯化次数驯化周期/d反应液体积/ml化合物浓度/mg·L一l860068006800700170017001700505050一50505050一2525252525,ó,自宁`,JCj,口、.产ó、少、.产11ù.1ō二且r、了吸、了、胺苯甲乙苯d孟J性连ó孟一J91,Jnj、夕、了、夕、,户,`,叼Q`,ó了吸、了、了、了.、邻二甲苯间二甲苯对二甲苯佣000044d压中中,潇自r内了月了ō了眨J亡J叹J工fUS、卫户、.少、J、.1、,产,曰n`,`八`乃`了.、了几、了吸、2`、廿r、苯一苯苯三一甲乙间二甲苯对二甲苯三甲苯养基为:59/L牛肉膏,109/L蛋白陈,59/LNac饰H一7.0;唯一碳源培养基与“菌源的来源和培养”一节中的培养基(2)相同.将盛有唯一碳源培养基的反应瓶灭菌后置摇床上振荡24h,在无菌条件下,将棉塞换成磨口塞,接种并加人化合物,封口后上摇床振荡培养.(2)菌悬液的制备将选好的菌株接种于50ml的活化富集培养基中,好氧振荡培养24h,分别取3ml菌液于离心管内,离心10min(8000r/mim),然后用磷酸盐缓冲液清洗,离心10min(10ooor/min),反复清洗3次,制成菌悬液备用.在无菌条件下进行操作.1.5分析方法样品预处理:振荡培养后的样品瓶从摇床上取出后立即放人冰箱中(4℃)平衡ht以上.然后加人15ml二氯甲烷,混匀后移至分液漏