_应用QC-PCR技术研究高效菌株Rhodococcus ruber Em1在废水处理中的作用

47卷2期2007年4月4日微生物学报ActaMicrobiologicaSinica47(2):307～3124April2007基金项目:国家“863计划”(2002AA601150)＊通讯作者。E-mail:liuzhp@sun.im.ac.cn作者简介:黄玲(1982-),女,湖南人,硕士研究生,从事环境微生物学研究。E-mail:huangling@mail.im.ac.cn其他作者:谭周亮收稿日期:2006-06-16;接受日期:2006-08-22;修回日期:2006-11-09应用QC-PCR技术研究高效菌株RhodococcusruberEm1在废水处理中的作用黄玲1,3,李习武1,李旭东2,刘双江1,刘志培1＊(1中国科学院微生物研究所北京100080)(2中国科学院成都生物研究所成都610041)(3中国科学院研究生院北京100039)摘要:应用竞争性定量PCR(QC-PCR)技术,对石化废水处理系统中投加的高效芳烃降解菌株RhodococcusruberEm1数量变化趋势及其作用进行了分析。持续5个月从处理系统中不定期采集活性污泥样品,进行Em1菌株定量测定和处理系统的效果分析。结果表明,基于16SrRNA基因的特异引物具菌种水平的特异性,用其扩增污泥总DNA,并对产物克隆测序,所扩增的产物中62.2%为Em1菌株16SrRNA基因片段。检测得到活性污泥样品中含Em1菌株数量范围为3.4×105～4.3×108CFUg,表明所投加的高效降解菌在处理系统中长期稳定存活并繁殖;Em1菌量与COD去除量之间的相关性系数(R2)高达0.89,表明Em1菌量与系统的处理效果具有明显的正相关性。这些结果说明,投加的Em1菌株在高浓度多环芳烃等污染物存在的条件和复杂菌群环境中,仍能长期稳定地存活并繁殖,在废水处理系统中发挥重要的作用。关键词:废水处理;高效菌;生物强化技术;QC-PCR;作用分析中图分类号:Q938文献标识码:A文章编号:0001-6209(2007)02-0307-06目前,包括炼油厂排放的污水等含多环芳烃的废水处理已成为环境治理的重大课题[1]。由于生物技术所具有的成本低、作用条件温和、无二次污染等优点[2],使其成为环境治理中的首选技术。其中投加高效菌的生物强化处理技术(bio-augmentation)是环境治理的重要发展方向[3]。为了更有效地控制生物强化处理过程,提高其效率,需要对加入的活性菌株的数量和降解活性进行实时检测。因而跟踪监测所投加的高效菌并分析其功能表达,是今后强化生物处理技术领域的又一研究热点[4～7]。然而,活性污泥是一个十分复杂的共生体系,微生物种类极其繁多且生态结构极其复杂,要对其中的某种微生物进行定量测定,若采用传统以培养为基础的方法[8],如稀释菌落计数法(Colonyformingunit,CFU),需要对所有的微生物进行分离纯化和分类鉴定等,不但工作量巨大、耗费大量的物力和财力,而且试验周期长,不能及时反映处理系统的状况;其次投加的高效菌种还受到活性污泥中很多因素,例如营养成分(碳、氮、磷源等)、温度、氧分压、含水量、pH值或盐浓度的变化等的影响,部分细胞转变为不可培养状态,无法进行纯培养,从而导致定量不准确。近20年来分子生物学方法在环境微生物学中得到了日益广泛的应用。从环境样品中直接提取细菌群体基因组DNA,并对16SrRNA基因进行克隆和序列分析[9],证明是对环境样品中不可培养菌进行检测和定量的有效方法。竞争性定量PCR(CompetitiveQuantitativePolymeraseChainReaction,QC-PCR)技术是基于某一细菌所特有的DNA序列进行细菌定量的分子生物学方法。已经被国外许多研究者应用于环境微生物群体的绝对组成和结构的研究[9,10],以及一个细菌类群或基因在群体中的动态变化分析[11]。本研究利用竞争性定量PCR技术对南充炼油废水处理系统中投加的高效菌数量动态变化进行定量分析,结合处理效果如COD去除量,进而分析该菌株在处理系统中发挥的作用。为生物强化技术处理炼油厂废水污染实时监控和高效菌株作用的发挥提供了可靠依据。DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2007.02.0241材料和方法1.1材料1.1.1菌种:赤红球菌Em1(RhodococcusruberEm1),分离于华北油田石油污染土壤,该菌株具有降解多种烷烃、多环芳烃及产生生物乳化剂的能力[12,13],已成功地应用于南充炼油厂废水处理工程。其他与Em1菌株不同亲缘关系的10个参照菌株:RhodococcusruberJCM3342,RhodococcuserythropolisDSM43060,RhodococcusrhodochrousDSM4