耐高COD淀粉废水的高产油脂粘红酵母的驯化和筛选

http://www.journal.buct.edu.cn第40卷第1期2013年北京化工大学学报(自然科学版)JournalofBeijingUniversityofChemicalTechnology(NaturalScience)Vol.40,No.12013耐高COD淀粉废水的高产油脂粘红酵母的驯化和筛选钟摇娜摇张志平摇张摇华摇张摇栩摇谭天伟*(北京化工大学生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室,北京摇100029)摘摇要:为减轻高COD淀粉废水对产油菌株粘红酵母生长的抑制,提高油脂产量,本文利用淀粉废水对该菌株进行了耐高COD梯度驯化,并采用流式细胞仪对经尼罗红染色的粘红酵母细胞进行了高油脂含量菌株的筛选。结果表明:经多次驯化后,粘红酵母耐受淀粉废水COD高达75000mg/L;流式细胞仪筛选得到一株油脂含量为25郾7%(质量分数)的粘红酵母,比原始菌株油脂提高了140%。400L发酵罐实验表明,在初始COD75000mg/L,葡萄糖质量浓度为36g/L,pH4郾8及30益条件下,培养33h后,粘红酵母生物量达25郾3g/L,菌体油脂含量为29郾5%,COD降至5600mg/L,降解率为92郾5%。关键词:粘红酵母;淀粉废水;流式细胞仪;微生物油脂中图分类号:Q939收稿日期:2012-03-19基金项目:国家“863冶计划(2009AA033001)第一作者:女,1986年生,硕士生*通讯联系人E鄄mail:twtan@mail.buct.edu.cn引摇言淀粉废水是食品工业中污染较严重的废水之一[1]。该废水中主要含有少量淀粉、纤维、蛋白质、糖类等高浓度有机物。如果直接采用工艺处理淀粉废水,则不仅因有机物浓度太高对处理造成很大困难,而且也因废水中有用物质的直接排放而造成很大的浪费[2]。微生物油脂又称为单细胞油脂,是生物柴油的原材料。许多微生物,如酵母、霉菌和藻类等都能够在一定条件下以碳水化合物、碳氢化合物等为碳源,在体内积累脂肪酸甘油酯[3]。然而,利用纯糖类或含糖农业作物为原料生产微生物油脂成本太高,不利于规模化放大[4-5]。含糖工业废水因其含有大量的还原性糖,而且分布集中,排放量大,是一个值得尝试研究的微生物碳源来源。利用粘红酵母处理高COD淀粉废水,生产微生物油脂的同时降低淀粉废水的COD,可实现废水的资源化利用,并且解决生物油脂生产原料问题[2,6-8]。之前相关研究都是取COD较低工段的淀粉废水(通常COD<30000mg/L)[9-10]或对淀粉废水适当稀释,以降低废水COD浓度[2],所以如何驯化筛选适应高浓度COD废水生长且油脂含量较高的菌株成为研究的首要任务。尼罗红染色剂是一种荧光染料,可以与细胞内的油脂进行特异性的结合,用尼罗红对细胞内油脂染色[11],并利用流式细胞仪筛选油脂含量高的菌种是一种非常快速方便的方法[12-13]。本文尝试采用COD梯度驯化粘红酵母,经多次驯化筛选适应高浓度COD淀粉废水的粘红酵母。尼罗红染色后,经流式细胞仪筛选,得到了一株耐高COD、高产油脂的粘红酵母菌株,大大节省了筛选菌种繁杂的工作量。1摇材料和方法1郾1摇菌种出发菌株为本实验室保藏的粘红酵母菌株(Rhodotorulaglutinis)。1郾2摇培养基配方液体淀粉废水培养基成分是V麸质水颐V浸泡液=4颐1,4%葡萄糖。固体淀粉废水培养基的成分是V麸质水颐V浸泡液=4颐1,20%葡萄糖[2],2%琼脂。(麸质水、浸泡液为不同工段的淀粉废水,培养基中无需再加入除糖以外的其他营养物质)。1郾3摇试剂与仪器浓硫酸,重铬酸钾,氯仿,三氯甲烷,甲醇,(NH4)2SO4,分析纯,北京化工厂;尼罗红荧光染料,上海杰美基因医药科技有限公司。HYG鄄A型回转恒温调速摇床,江苏太仓市实验设备厂;COD快速测试仪,包括CR3200型加热消解http://www.journal.buct.edu.cn器和PhotolabS,光电比色计,德国WTW公司;紫外诱变箱,济南洁康空气净化设备厂;流式细胞仪,BD公司;5L发酵罐,上海暴行生物设备工程有限公司。1郾4摇驯化和紫外诱变方法将粘红酵母接种到淀粉废水培养基中发酵,测其生长状况,72h后,再转接到新鲜淀粉废水培养基中进行下一轮的驯化,如此重复多次。取直径9cm无菌平板,培养基为淀粉废水固体培养基,涂布稀释至合适浓度的粘红酵母菌悬液,在等距40cm、功率为25W紫外灯下照射。1郾5摇尼罗红染色方法取200滋L发酵液离心,用磷酸缓冲液洗涤2次,再加入含KCl0郾15mol/L的无菌磷酸缓冲液溶解。取40滋L尼罗红染色剂到160滋L的丙酮中,向上述处理后的菌液中加入20滋L尼罗红丙酮溶液,避光,放在摇床中染色30min。取出后,离心,用PBS洗涤菌体2次,洗去附着的染色剂,离心