嗜吡啶红球菌多氯联苯降解基因的克隆与表达

中国环境科学2004,24(6)：734~737ChinaEnvironmentalScience嗜吡啶红球菌多氯联苯降解基因的克隆与表达孙艳,杨秀清,钱世钧*(中国科学院微生物研究所,北京100080)摘要：建立了多氯联苯/联苯降解菌嗜吡啶红球菌R04的基因组文库.活性筛选得到1个18kb的阳性片断,内含1个921个核苷酸的新的开环酶2,3-二羟基联苯双加氧酶基因bphC2,该基因能够在大肠杆菌中表达,其蛋白分子量约为34kDa.此外,在该基因上游39bp处还发现另外一个2,3-二羟基联苯双加氧酶基因bphC1的部分序列.关键词：多氯联苯/联苯；生物降解；2,3-二羟基联苯双加氧酶；基因表达中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2004)06-0734-04Cloningandexpressionofpolychlorobiphenyl/biphenyldegradinggenefromRhodococcuspyridinovorans.SUNYan,YANGXiu-qing,QIANShi-jun(InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China).ChinaEnvironmentalScience,2004,24(6)：734~737Abstract：AdegradinggenomiclibraryofpolychlorobiphenylbiphenylinRhodococcuspyridinovoransR04wasconstructed.A18kbfragmentwasobtainedwithactivescreening,containinganewdihydroxybiphenyldioxygenasegene(bphC2),whichcouldbeexpressedinE.colianditsproteinmolecularweightwasabout34kDa.Inaddition,in39bpinupstreamofthegene,therewasanotherpartialsequenceof2,3-dihydroxybiphenyldioxygenasegenebphC1.Keywords：polychlorobiphenyl/biphenyl；biodegradation；2,3-dihydroxybiphenyldioxygenase；geneexpression多氯联苯(PCB)是一种严重的致癌和致畸剂,是12种持续性污染物之一,由于其化学稳定性高,进入环境的PCB在相当长时间内仍会对环境产生影响[1].与物理和化学方法相比较,PCB污染的生物修复费用低,降解彻底,不造成二次污染,被认为是最有前景的修复手段[2].作者以一株从华北油田分离得到的高效PCB/联苯降解菌嗜吡啶红球菌R04[3,4]为研究对象,构建了其基因组文库,克隆和表达了在PCB降解途径中起重要作用的开环酶2,3-二羟基联苯双加氧酶(BphC).为检测PCB污染和构建生物工程菌进行环境修复提供参考.1材料与方法1.1酶与试剂2,3-二羟基联苯购自和光纯药工业株式会社;四环素购自中国药品生物制品检定所;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)、包装蛋白(PackageneLambdaDNAPackagingSystem)购自Promega公司;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)与各种DNA限制性内切酶购自华美公司;去磷酸化酶、T4DNA连接酶购自宝生物公司.其他化学试剂均为分析纯.1.2菌株、质粒和培养条件嗜吡啶红球菌R04由中国科学院微生物研究所微生物酶研究和应用实验室筛选,大肠杆菌E.coliDH5为实验室保存.含黏粒载体pLARF3的E.coliBL17-1由Dr.PeterN.Golyshin(德国生物技术研究中心)馈赠.质粒载体pBluescriptIISK和IIKS由中国科学院微生物研究所张渝英研究员馈赠.嗜吡啶红球菌R04的培养条件同文献[3].大肠杆菌在LB培养基中37℃培养,E.coliBL17-1的LB培养基中含四环素10µg/mL.1.3bphC基因的克隆分别用HindIII和EcoRI酶切20µg纯化的黏粒pLARF3,再用BamHI分别进行酶切,得到2个黏粒臂.按文献[5]所述的细菌基因组DNA提取收稿日期：2004-03-09基金项目：国家“863”项目(2002AA601170)*责任作者,研究员,qiansj@sun.im.ac.cn6期孙艳等：嗜吡啶红球菌多氯联苯降解基因的克隆与表达735法稍作改进后提取嗜吡啶红球菌R04基因组DNA.用Sau3AI部分酶切嗜吡啶红球