差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察

差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察罗靖莹ꎬ贺宏丽ꎬ郭阳ꎬ黄玮玮ꎬ黄晓波(电子科技大学附属医院/四川省人民医院ꎬ成都６１００７２)摘要:目的观察差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞(ＢＭＳＣｓ)外泌体提取中的应用ꎬ筛选外泌体最佳离心提取方法ꎮ方法取ＢＭＳＣｓ培养４８ｈ后收集细胞上清ꎬ平均分成Ａ、Ｂ、Ｃ组ꎬ分别使用差速离心技术、密度梯度离心技术、超滤离心技术提取外泌体ꎻ记录各组外泌体提取时间ꎻ采用负染色技术观察各组外泌体形态ꎻ使用纳米颗粒跟踪分析仪测算各组外泌体浓度及大小ꎻ采用ＢＣＡ法测定外泌体总蛋白浓度ꎻ采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测各组外泌体表面标志蛋白ＣＤ９、ＣＤ６３、Ａｌｉｘꎮ将肺微血管内皮细胞(ＰＭＶＥＣｓ)分成５组ꎬＥＣ组上室加入ＰＭＶＥＣｓ及培养基ꎻＬＰＳ组上室加入ＰＭＶＥＣｓ及含ＬＰＳ的培养基(构建内皮细胞损伤模型)ꎻＡ、Ｂ、Ｃ组上室加入方法同ＬＰＳ组ꎬ下室分别加入Ａ、Ｂ、Ｃ组外泌体ꎻ采用葡聚糖渗漏实验检测外泌体内皮细胞通透性(观察外泌体对内皮细胞的修复作用)ꎬ以内皮细胞通透指数表示ꎮ结果Ａ、Ｂ、Ｃ组的外泌体的提取时间分别为(１８０±８)、(２０３±１０)、(４０±５)ｍｉｎꎬＡ、Ｂ组外泌体的提取时间与Ｃ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎮ各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ边界清晰ꎬ但仅Ａ组外泌体可见到典型的杯状结构ꎮＡ、Ｂ、Ｃ组的外泌体浓度分别为(４.４６±０.３８)×１０８/ｍＬ、(５.１１±０.１６)×１０８/ｍＬ、(２.１８±０.１７)×１０８/ｍＬꎬＡ、Ｂ组与Ｃ组外泌体浓度相比ꎬＰ均<０.０５ꎮＡ、Ｂ、Ｃ组的外泌体大小均为２０~１００ｎｍꎮＡ、Ｂ组外泌体总蛋白浓度及ＣＤ６３、Ａｌｉｘ的相对表达量均显著高于Ｃ组(Ｐ均<０.０５)ꎮＡ、Ｂ、Ｃ、ＬＰＳ、ＥＣ组的内皮细胞通透指数分别为２.１７±０.１５、１.７７±０.３２、２.３７±０.４２、２.９３±０.１５、１.００±０.００ꎬＡ、Ｂ、Ｃ、ＬＰＳ组的内皮细胞通透指数与ＥＣ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎻＡ、Ｂ组的内皮细胞通透指数与ＬＰＳ组相比ꎬＰ均<０.０５ꎮ结论密度梯度离心技术虽耗时较长ꎬ但提取的外泌体纯度、浓度较高ꎬ对内皮细胞的修复作用较强ꎬ可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法ꎮ关键词:外泌体ꎻ外泌体提取方法ꎻ差速离心技术ꎻ密度梯度离心技术ꎻ超滤离心技术ꎻ间充质干细胞ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ肺微血管内皮细胞ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０１９.１２.０１３中图分类号:Ｒ３３文献标志码:Ａ文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０１９)１２￣００４８￣０５基金项目:四川省医学科学院ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬａｎｄｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＬＵＯＪｉｎｇｙｉｎｇꎬＨＥＨｏｎｇｌｉꎬＧＵＯＹａｎｇꎬＨＵＡＮＧＷｅｉｗｅｉꎬＨＵＡＮＧＸｉａｏｂｏ(ＴｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｅｏｐｌｅ'ｓＨｏｓｐｉｔａｌꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００７２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣｓ)ꎬａｎｄｔｏｆｉｎｄｏｕｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｍｅｔｈｏｄ.ＭｅｔｈｏｄｓＡｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇｆｏｒ４８ｈꎬｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｏｆＢＭＳＣｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｒｏｕｐｓＡꎬＢａｎｄＣ.Ｔｈｅｅｘｏｓｏｍｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬａｎｄｕｌ￣ｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｒｅｃｏｒｄｅｄ.Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｅａｃｈ