超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺研究

超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺研究廖启元，经嘉，王晓阁，刘东平，刘丽敏（安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000）摘要：研究了超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺.以多糖保留率和蛋白脱除率为评价指标，考察了截留分子量、温度、压力、多糖浓度、时间对超滤效果的影响.当选用截留分子量（MWCO）30000、温度25℃、压力0.10MPa、多糖的浓度3.0mg/mL时，超滤处理100min，多糖保留率和蛋白脱除率分别为78.2%和77.1%，优于Sevag法和TCA法.超滤法是一种可行的脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的方法.关键词：猫爪草；多糖；脱蛋白；超滤中图分类号：R91文献标识码：粤文章编号：员远苑员原怨苑源猿（圆园员8）05原园园园4原园5收稿日期：2018-03-08基金项目：安徽省教育厅重点项目“猫爪草多糖的提取分离及抗炎作用研究”（KJ2016A420）.作者简介：廖启元，1979年生，男，湖北武汉人，讲师，研究方向：药学.猫爪草（RanunculusternatusThunb）又称小毛茛、三散草，是毛茛科毛茛属一年生草本植物，1977年收载于《中华人民共和国药典》[1].研究表明，猫爪草具有抗肿瘤、抗菌、调免疫、抗氧化等作用[2]，多糖为其重要活性成分之一[3].目前，已有文献报道猫爪草多糖的水提醇沉工艺[4]，但所得多糖含有大量蛋白杂质，需进行脱蛋白处理加以纯化.超滤是一种新兴高效的膜分离技术，在切向流过程中，大分子溶质随溶液切向流经膜表面，而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过超滤膜致密层上的微孔而进入膜另一侧，从而实现不同分子量物质的分离[5].猫爪草粗多糖中，多糖与杂蛋白虽均为大分子物质，但两者分子量有所差异.基于此，本文研究了利用超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白杂质的工艺，以期探索一种更为简单有效的植物多糖脱蛋白方法.1材料与方法1.1试验材料猫爪草材料购于安徽亳州中药材市场，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌教授鉴定为毛茛科植物猫爪草；FA1204N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；RE5298A旋转蒸发仪（西安禾普生物科技有限公司）；UV-1800型紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）；DZKW-S-4电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器有限公司）；PHS-25型pH计（上海今迈仪器仪表有限公司）；80-2B离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；Vivaflow50及配件（德国sartorius公司）；BT-100恒流泵（上海沪西分析仪器有限公司）；DF-101S集热式磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）；葡萄糖、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、氢氧化钠、双氧水（质量浓度30%）等试剂均为分析纯.1.2试验方法1.2.1猫爪草粗多糖的提取及脱色称取猫爪草500g，粉碎过24目筛，粉末用石油醚回流脱脂3次，每次6h.挥去石油醚后加20倍量水，于90℃提取2次，每次2h.离心合并上清液，减压浓缩至500mL，加入4倍体积无水乙醇，冷藏过夜.离心收集沉淀、干燥，得猫爪草粗多糖.加蒸馏水复溶至多糖浓度约为1.0mg/mL作待脱色液.将待脱色液按pH9.0、温度45℃、双氧水用量20%的条件脱色60min，而后减压浓缩，用0.45μm微孔滤膜过滤，调整多糖浓度作超滤原料液备用.1.2.2超滤方法按照图1所示，连接超滤装置及附件，超滤过程中不断补充等温的蒸馏水，保持原料液体积维持不变.1.2.3多糖含量测定-苯酚硫酸法[6]1.2.4蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法[7]1.2.5多糖保留率的计算第37卷第5期2018年5月怀化学院学报JOURNALOFHUAIHUAUNIVERSITYVol.37.No.5May，2018多糖保留率=保留液中多糖质量原料液中多糖质量×100%1.2.6蛋白脱除率的计算蛋白脱除率=原料液中蛋白质量-保留液中蛋白质量原料液中蛋白质量×100%2结果与分析2.1超滤膜的选择取原料液300mL，调整多糖浓度为1.0mg/mL，温度15℃、超滤压力0.10MPa，分别选择截留分子量（MWCO）为10000、30000、50000、100000的Vivaflow50型超滤膜进行脱蛋白处理.当透过液达300mL时结束超滤，考察不同截留分子量对脱蛋白效果的影响，结果如表1所示.由表1可知，随着超滤膜的截留分子量逐渐增加，超滤时间不断减少，对应的平均通量迅速提高.当选用MWCO10000时，多糖的保留率为87.6%，此时蛋白脱除率为75.6%，脱蛋白效果较好，但效率较为低下.当选用MWCO30000时，多糖的保留率为76.7%，蛋白脱除率为77.3%，相比于MWCO10000时脱蛋白效果多糖保留率有所降低，但耗时从337min减少至99min，效率大大提高.选用MWCO