超滤去除丹参滴注液高分子杂质的效果研究

超滤去除丹参滴注液高分子杂质的效果研究刘将1，马伟2，周仓2*（1.上海华源安徽锦辉制药有限公司，安徽阜阳236000；2.亳州学院中药学院，安徽亳州236800）摘要：对丹参滴注液超滤前后药液中高分子物质的截留去除情况进行探索研究，用以考察丹参滴注液中存在的高分子成分及使用超滤后截留去除高分子成分的作用.通过选择适宜分子量截留值的超滤膜，得到超滤后丹参滴注液，并以蛋白质、多糖、树脂、鞣质等成分为考察指标，研究超滤去除丹参滴注液中高分子杂质的效果.研究结果表明，未能在超滤后丹参滴注液中检测出蛋白质、树脂、鞣质等无效成分.因此，通过超滤能有效截留和除去丹参滴注液中的与药效无关的高分子物质，从而提高产品质量和临床使用的安全性.关键词：丹参注射液；超滤；高分子无效成分中图分类号：R-33文献标识码：粤文章编号：员远苑员原怨苑源猿（圆园员8）11原园园86原园3收稿日期：2018-10-06作者简介：刘将，1979年生，男，安徽阜阳人，高级工程师，研究方向：药品研发、生产和质量管理；*通讯作者：周仓，1964年生，男，安徽阜阳人，正高级工程师，研究方向：制药和制药设备专业.中药有效成分的分子量一般不大于1000，而中药注射剂中的大分子成分蛋白、多糖、鞣质及树脂等分子量均在5万以上[1]，这些大分子物质的存在，是导致其不良反应的主要原因.而超滤是以截留分子量为特征的一种过滤方式，能够有效去除中药注射剂分子量较大的高分子杂质，如蛋白、多糖、鞣质及树脂和热原等物质[3-6].如四川雅安制药厂用超滤法制备丹参注射液，与原工艺相比，超滤法不采用助溶剂吐温-80（吐温-80导致心脏等器官不良反应），可获得稳定的澄明度，从而使丹参注射液更适宜于静脉给药[2].本文主要对丹参滴注液超滤前后药液中高分子物质进行了探索研究.1仪器与材料Waters510高效液相色谱仪（美国Waters公司）；对照品：葡聚糖（分子量40000，NO257688）北京经科公司；葡聚糖（分子量10000，NO278605）北京经科公司；水苏糖（分子量666，078K3802）Sigma；棉籽糖（分子量504）北京楚和霞光生物技术发展中心；蔗糖（分子量342，990327）中国华东师范大学化工厂；葡萄糖（分子量180，20070120）科密欧化学试剂有限公司；D-葡萄糖醛酸（分子量194，648-2000001）中国药品生物制品检验所.2方法与结果2.1超滤去除蛋白成分研究2.1.1鞣酸检测法检测蛋白含量采用2015版《中国药典》注射剂有关物质检查法中蛋白质检查方法进行检测，结果超滤前后药液均未能检出蛋白.2.1.2Braford法检测蛋白含量本法采用Braford蛋白含量检测试剂盒，依法试剂盒检测要求进行.取6个带盖的1.5mL离心管分别加入考马斯亮蓝G-250溶液1980滋L并编号为0、1、2、3、4、5号管，按顺序分别加入去离子水20、16、12、8、4、0滋L，蛋白标准溶液0、4、8、12、16、20滋L，混匀后放置2min后依次在595nm下比色测定，得蛋白质含量分别为：0、2、4、6、8、10滋g/mL.以蛋白浓度X为横坐标，吸光度为Y纵坐标，进行线性回归，得标准曲线为：Y＝0.0281X+0.0696，r2＝0.9986.结果表明，蛋白浓度在2～10滋g/mL时呈线性关系.然后取样品稀释液20滋L，加入考马斯亮蓝G-250溶液1980滋L，充分混匀，放置2min后，以0号管做参比，在595nm波长下比色并记录吸光值.最后参考标准曲线，根据样品吸光度，计算样品蛋白含量，得超滤前后药液中蛋白含量为18.20滋g/mL及7.67滋g/mL，说明超滤后药液中蛋白含量有明显下降.2.1.3Elisa法检测蛋白含量取丹参蛋白对照溶液，加包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）倍比稀释成100，10，0.5滋g/mL的溶液，采用常规ELISA法，将包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）倍比稀释的丹参抗原包被在96孔聚乙烯酶标板上，4℃湿盒过夜，PBS洗2遍，用2%小牛血清白蛋白溶液（溶剂为PBS溶液，pH7.4）封闭10min，加入100滋L1∶500（PBS）稀释的兔抗丹参血清（一抗）2hr，PBS洗5遍，加入100滋L1：3000-10000（PBS）辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG溶液（二抗）2hr，PBS洗5遍，100滋LOPD/H2O2底物磷酸缓冲液，最后加100滋L的2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm处记录吸收度.以log浓度和吸收度，绘制标准曲线.同法测定供试品溶液的吸收度，并参考标准曲线，根据样品吸光度，计算样品蛋白质含量，结果显示，在超滤前液中能够检出丹参蛋白质含量，超滤能够除去在醇沉工艺中未完全除去的蛋白质成分.2.2超