当归红芪超滤物对顺铂诱导大鼠肾足细胞损伤的保护作用研究

图１倒置相差显微镜观察不同分组肾足细胞的生长的代表图甘肃中医药大学药学院生药学教研室鉴定:红芪是豆科岩黄芪属植物多序黄芪的干燥根茎,当归为伞形科植物的干燥根,RASＧRH参照本研究小组前期制作流程和结果,由甘肃中医药大学科研实验中心与甘肃省膜科学研究院联合制备.１．１．３试剂及仪器倒置相差显微镜(日本OLYMＧPUS);Thermo３１１CO２培养箱(美国Thermo公司);电动离心机(金坛市恒丰仪器厂);SCSＧ２４摇床(上海市离心机械研究所);精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);高糖培养基、０．５％胰蛋白酶、TriＧzonXＧ１００、胎牛血清、１００×青霉素Ｇ链霉素溶液均为美国HyClone公司产品;超净工作台、流式细胞仪、EＧPlate１６孔细胞检测板、xCELLigenceRTCA实时细胞功能分析仪(艾森生物Ｇ杭州有限公司);顺铂(６J０１４A８９)上海谱振生物科技有限公司.１．２方法１．２．１RASＧRH的制备当归、红芪饮片以１∶５的比例混合,水煎煮两次,过滤水煎液并加热浓缩后,陶瓷膜微滤浓缩液(技术参数为压力０．２mPa/m３、温度２５℃,流量１０L图３流式细胞仪检测不同分组凋亡率的代表图３讨论«中国药典»载当归为伞形科植物的干燥根,具有“补血、活血、调经止痛”等功效[３].研究表明,当归所含的生物活性物质主要是挥发性与非挥发性化学物质,而产生效应的主要有挥发油、藁苯内酯、阿魏酸、多糖等成分[４].红芪为豆科岩黄芪属植物,«中国药典»收载的常用中药红芪为多序岩黄芪的根,红芪入药史载于南北朝梁Ｇ陶弘景著的«本草经集注»,具有“扶正祛邪,益气固本”的功效[３].红芪含有多糖、生物碱、黄酮、氨基酸等物质,且多糖为红芪中最主要的活性成分,是一种杂多糖,具有抗氧化、抗癌、提高机体免疫力等作用[５].寇宁等[６]研究表明,红芪多糖具有较强的清除羟自由基、超氧阴离子自由基及１,１Ｇ二苯基Ｇ２Ｇ三硝基苯肼(DPPH)自由基等作用.近年来一些研究证明,RASＧRH中,红芪补血,当归养血,两药合用共奏补气生血之功,使血气旺盛,肾精髓海充足[７].研究发现,红芪多糖能明显抑制多种肿瘤细胞增殖,可通过增强机体免疫能力抗癌,还能在体外致使肿瘤细胞周期停滞、诱导部分肿瘤细胞凋亡、对化疗药物起减毒增敏效果等[８].王小军等[９]利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术研究发现,红芪多糖Ｇ１可促进人肺腺癌A５４９细胞活性氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)的上调,同时促进谷胱甘肽(GSH)、总超氧化物歧化酶(TＧSOD)、总抗氧化能力(TＧAOC)的下调,不同剂量红芪多糖Ｇ１均具有抗肿瘤活性的作用,提示其抑制人肺腺癌A５４９细胞增殖、诱导凋亡可能与调控细胞内氧化/抗氧化机制平衡有关.刘华等[１０]通过流式细胞仪及RTＧPCR法研究红芪多糖诱导肺腺癌细胞凋亡与Bax/BclＧ２表达,观察发现不同浓度的红芪多糖均可诱导A５４９细胞凋亡,均可降低BclＧ２蛋白的表达,相应提高Bax蛋白的表达,且呈浓度依赖性,其机制可能是通过调节细胞内BclＧ２和Bax蛋白的表达而诱导A５４９细胞的凋亡.张艳霞等[１１]采用MTT比色法检测当归挥发油对SPCＧAＧ１细胞的细胞毒作用;流式细胞术检测SPCＧAＧ１细胞凋亡及周期;吖啶橙/溴化乙啶(AO/BE)双荧光染色法观察SPCＧAＧ１细胞凋亡,研究发现当归挥发油可诱导SPCＧAＧ１细胞凋亡,推断出当归挥发油可能通过阻滞细胞于G２期,从而起到抑制SPCＧAＧ１细胞增殖的作用.安静等[１２]实验采用AOM/DSS诱导小鼠炎症相关结直肠癌模型,探究当归多糖、当归油对肿瘤的预防作用,结果表明此两种当归提取物单独使用时均具有降低肿瘤发病率及抑制肿瘤发展的作用,且两者具有协同作用,以当归油与高剂量的当归多糖配伍对结直肠癌的发生、发展抑制作用最强.顺铂作为主要抗肿瘤药物,在临床上被广泛利用,但其在杀死肿瘤细胞的同时亦损伤正常细胞,且伴有严重的肾毒性[１３],成为顺铂化疗在临床上应用的瓶颈.肾小球足细胞的滤过功能是肾脏生理功能的基础,足细胞病变是导致慢性肾小球肾炎滤过功能损伤的决定因素[１４].顺铂可导致DNA物理结构的损伤,而这些损伤能被细胞内的损伤识别蛋白所识别,从而启动包括蛋白激酶、cＧabl和p５３在内的信号转导途径,这些途径一经启动都可诱导细胞凋亡[１５].本研究采用倒置相差显微镜和RTCA实时细胞分析观察发现顺铂对大鼠肾足细胞的增殖具有明显的抑制作用,而RASＧRH可以对顺铂导致的细胞损伤具有一定的保护作用;同时RTCA观察细胞增殖抑制的动态改变,流式细胞仪检测顺铂组[(２５．８０±２．９４)％]的凋亡率要明显高于对照组[(２．６８±０．１１)％]、药物组[(６．２４±０．３５)％]、联合组[(１０．９８±１．