好氧反硝化菌的分离及其在土壤氮素转化过程中的作用

第43卷第3期2006年5月土壤学报ACTAPEDOLOGICASINICAVo1．43．No，3May，2006好氧反硝化菌的分离及其在土壤氮素转化过程中的作用*周立祥卡黄峰源王世梅(南京农业大学资源环境科学学院环境工程系，南京210095)摘要在土壤厌氧条件下发生的生物反硝化作用是影响作物对土壤氮素利用率和影响环境质量的重要氮素转化过程。本研究从土壤中分离到在好氧条件下也能进行反硝化的3株细菌。其中1株为严格好氧的异养菌，编号为AD26。另外2株为兼性菌，分别为AD7和AD60。根据其形态和生理生化特征初步鉴定为假单胞菌属(Psudomonnssp．)。在好氧培养的液体培养基中AD26和AD7在24h内能通过反硝化作用使硝态氮表观损失率分别达到21％和18％。而在好氧的土壤培养中，二个菌株在3d内能使土壤中硝态氮表观损失率达到56％，同时少有反硝化中间产物的积累。因此，在农业生产中不应忽视在好氧条件下的生物反硝化作用。关键词好氧；反硝化细菌；分离；土壤；氮形态中图分类号S154．3文献标识码A硝化与反硝化作用是土壤氮素最重要的转化过程，既影响作物对氮的利用率⋯，也影响水气的环境质量(如硝酸盐对地下水的污染、氮氧化物对大气的影响等)E1，。研究发现，我国每年农田氮肥的损失率达33．3％～73．6％，其中反硝化作用导致氮的损失占整个氮损失率的15％J，也是水田土壤氮素损失最重要的途径之一4J。因为硝酸盐在水田淹水的厌氧土层中能被反硝化细菌最终转化为氮氧化物(如N，O，NO等)或氮气而挥发损失。因此，长期来普遍认为生物反硝化过程是严格的厌氧过程。然而近年来，在水处理中研究发现，生物反硝化也可发生在有氧条件下，并发展出在有氧条件下同步硝化反硝化的污水处理脱氮工艺l5J。分离出的好氧反硝化菌有Pseduomonassp．，Alcaligenesfi,ecalis，Thiosphaerapantotrophal5等。虽然在水田土壤中尚未确定是否也存在具有明显的反硝化作用的好氧反硝化细菌，但近10年来，人们在稻田温室气体排放通量研究中，几乎都发现氧化亚氮排放高峰并非在氧化还原电位较低的淹水期而是在氧化还原电位较高的搁水晒田初期E6一J。这一现象虽被许多研究者解释为晒田初期土壤中易形成较多的反硝化作用底物——硝态氮从而有利于形成氧化亚氮，但也不能排除来自于生物好氧反硝化作用的原因。为此，我们采用纯培养单菌的方法，研究了从土壤中分离纯化好氧反硝化菌及其在土壤中好氧反硝化作用的大小，为深入研究土壤氮索反硝化作用机制提供科学依据。1材料与方法1．1好氧反硝化菌的分离和纯化将新鲜肥沃的菜园土10g在90ml无菌水中作系列稀释，取稀释梯度10～、10的悬浊液分别在牛肉膏蛋白胨硝酸盐固体培养基(肉汁胨培养基加l‰KNO，pH7．2～7．4)平板上涂布，于28℃，培养3～4d。挑选形态各异的菌落(共66个)分别接种于装有3ml的以硝酸钾为唯一氮源的硝酸柠檬酸反硝化液体培养基(培养基组成为：柠檬酸钠5．00g、KNO32．O0g、KH2P041．O0g、MgSO4‘7}12O0．20g、去离子水1000ml、pH7．2)试管中，于28℃，180rrain下，振荡培养1周。然后在各试管中加入l～2滴Griess试剂以检测是否有亚硝酸盐的存在，如溶液马上呈粉红色、棕色等，说明硝酸盐被还原成亚硝酸盐，该溶液中具有好氧反硝化作用的细菌。如无红色出现，则进一步加入二苯胺试剂，培养液若呈蓝*新世纪优秀人才支持计划(NCET一04—0505)十通讯作者，Email：lxzhou@auedu．cn作者简介：周立祥(1965)．男，湖南衡山人，博士，教授。主要从事固废处理、环境化学与环境微生物方面的研究。Tel：025—84395160收稿日期：2005—03—09；收到修改稿日期：2005—07—3l维普资讯http://www.cqvip.com3期周立祥等：好氧反硝化菌的分离及其在土壤氮素转化过程中的作用431色，则表示培养液中硝酸盐未被转化，溶液中无反硝化细菌。若无色，则表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都已还原成氮氧化物，该溶液中具有较强作用的好氧反硝化功能的细菌。在上述试管中检测到有好氧反硝化细菌后，将试管中菌液接种到硝酸柠檬酸反硝化平板上采用涂布法进行细菌分离，在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落做涂片镜检，若有不纯，则进一步挑取此菌落作划线分离，直至获得目的菌株的纯培养，并转移到硝酸柠檬酸反硝化斜面保存备用。1．2菌株好氧反硝化作用验证及初步鉴定从硝酸柠檬酸反硝化斜面上取一环纯菌种回接到装有100ml灭过菌的硝酸柠檬酸反硝化液体培养基的250ml三角瓶中，置于28℃，180rmin下，振荡培养5d。每隔24h从三角瓶中取1ml样品，采用过硫酸钾氧化．紫外分光光