流式细胞术在水生生物DNA含量和倍性分析中的应用

第21卷第2期2008年11月水产学杂志CHINESEJ0URNALFISHERIESVo1．21：No．2NOV．2008文章编号：1005—3832(2008)02—0021—04流式细胞术在水生生物DNA含量和倍性分析中的应用耿波．孙效文(中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨150070)摘要：利用流式细胞仪对鲤鱼、银鲫、黄颡、牙鲆等淡水和海水鱼类进行了DNA含量测定或倍性分析。通过几百个样品的测定和分析，认为流式细胞仪在DNA相对含量测定和倍性分析上结果比较稳定一致，可以用于大量样品的测定分析。同时对待测样品的保存、处理及上样量等进行了一系列比较研究，找出最好的保存方法、最简便的样品处理方法和最少的上样量。流式细胞仪在水生生物的遗传育种、种群分化等方面有很重要的应用价值。关键词：流式细胞术；DNA含量测定；倍性分析中图分类号：Q343．2文献标识码：A流式细胞术(FlowCytometry)是70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA／RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速(每秒可达1000—10000个)、客观多参数相关检测分析的新技。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理，同时利用荧光染料，激光技术，单抗技术以及计算机技术的发展，大大提高了检测速度与统计精确性，而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数，为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。流式细胞术在医学上应用广泛，在科研上主要应用于细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究等方面。FCM在生命科学中的应用，标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器。目前在水生生物中多数用于DNA含量和倍性方面的研：。DNA含量的测定方法有：二苯胺法，紫外吸收法，流式细胞术(FcM)等方。DNA含量检测是流式细胞仪最早且目前仍然最广泛的应用之一。DNA含量分析还可以提供细胞周期信息，所以它也可作为细胞生物学的一个有用的工具。DNA含量和倍性在描述物种的特征和分类上十分重要。收稿日期：2008—06—07基金项目：国家计划(973)项1~t(No．2004CB117405)。作者简介：耿波(1975-)，女，助理研究员，博士，主要从事分子遗传学研究。E-mail：ppgeng@sohu．tom通讯作者：孙效文，E—mail：sunxw2002@163．com·22·水产学杂志第21卷1材料和方法1．1实验材料本实验中使用的流式细胞仪是贝克曼有限公司的CellLabQuanta—AfordableFlowCytometrySystem，其它的试剂和耗材如过滤管、DAPI荧光染料、DNA标准样品、流动液、稀释液等均购自贝克曼有限公司。各种鱼类样品分别采自天津、大连、黑龙江、辽宁等地。1．2样品的采集、保存和处理本实验对新鲜样品的各种保存条件如直接冷冻保存、保存在不同浓度的乙醇中及保存的温度等进行了摸索和优化；对血液样品的保存时间及上样量进行了摸索；还构建了样品处理的最简便有效的程序。如下：(1)新鲜样品鱼类样品的采集主要有两个部位，组织(鳍条)和血液。根据实验条件和目的选择采样的部位。鳍条样品应尽量大些，用镊子研磨或刀片切碎固体样品(如鳍条)加入200LPBS缓冲液振荡悬浮，用300目砂网过滤备用。采集血液时，在注射器内浸润肝素钠抗凝剂后，从鱼体背部脊柱下静脉采血，所需血量很少，见血即可。(2)冷冻样品新鲜样品采集后来不及处理，可将固体组织保存在70％乙醇中并置于一20％冰箱中存放不超过一个月。含有肝素钠的血液样品置于4℃冰箱中可存放一周左右。冷冻的固体组织在处理时要先在蒸馏水中浸泡并用滤纸吸去多余的液体，以去除乙醇。其余处理方法参照新鲜样品。l_3染色细胞悬浮液(或血液)加入400—500LDAPI染料4~C避光染色15min，用过滤管filtertip过滤。1．4上样将染色后的细胞悬液置于样品杯内，开始测样。计数到5000～10000个细胞，停止测样。按Recoversample一按钮回收样品并按Rinse清洗针头。以准备下面样品的测定工作。上样时设置标准样品对照，进行DNA倍性测定时，采用鲑鱼血细胞作为标准二倍体对照，进行DNA含量测定时，采用小公鸡血作为DNA含量的标样。测样结束后，执行2-3次清洗循环(Cleaningcycle)，再作一次flush后执行正常的关机程序。1．5数据和图形分析根据标准样品、对照样品和待测样品excel文件中的FL1linearmean数值来判断待测样品的DNA倍性，同时可采用小公鸡血的DNA含量作为测定鱼类样品DNA含量的标准对照。2结果2．1样品的采集、处理及保