13.4.1目标微生物的分子生物学检测 - 目标微生物的分子生物学检测

1第四节第四节目标微生物的分子生物学检测目标微生物的分子生物学检测一、PCR-DGGE技术技术*PCR-DGGE技术技术是PCR（polymerasechainreaction）技术和技术和DGGE（denaturinggradientgelelectrophoresis）技术的组合技术的组合。该技术已成为环境微生物研究的重要手段该技术已成为环境微生物研究的重要手段，在污染菌跟踪检测中的作用也越来越大污染菌跟踪检测中的作用也越来越大。2（一）PCR-DGGE技术的技术的原理原理*16SrRNA是原核生物核糖核蛋白体的组成成分是原核生物核糖核蛋白体的组成成分，其大小约其大小约为1500bp。每种原核微生物都有特定的每种原核微生物都有特定的16SrRNA序列序列。从样品中提取微生物总样品中提取微生物总DNA，用特异性引物对用特异性引物对16SrDNA（编码16SrRNA的基因的基因）进行进行PCR扩增扩增，再采用再采用DGGE技术分技术分离扩增产物离扩增产物，通过测序获得样品中的通过测序获得样品中的16SrDNA序列信息序列信息，再与再与16SrDNA数据库中的序列数据进行比对数据库中的序列数据进行比对，建立系统发建立系统发育树育树，即可鉴定样品中的原核微生物种类即可鉴定样品中的原核微生物种类。3（二）PCR-DGGE技术的应用技术的应用1、检测致病菌检测致病菌单核细胞增生利斯特氏菌单核细胞增生利斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）是一种引起人类脑膜炎的致病菌是一种引起人类脑膜炎的致病菌，广泛存在于蔬菜广泛存在于蔬菜、肉类肉类和家禽上和家禽上。1992年，Niederhauser等人应用等人应用PCR-DGGE技术扩增该致病菌中的技术扩增该致病菌中的hlyA和iap基因基因，检测时间只需几检测时间只需几个小时个小时。采用这种技术检测采用这种技术检测100个样品个样品，阳性检出率显著阳性检出率显著高于经典培养法高于经典培养法。42、检测基因工程菌检测基因工程菌1989年，Chaudry等人将一个基因工程菌接种于经过过滤等人将一个基因工程菌接种于经过过滤除菌的湖水及污水中除菌的湖水及污水中，定期取样定期取样，采用采用PCR-DGGE技术扩技术扩增该工程菌的标记物增该工程菌的标记物（0.3kbDNA片段片段）。跟踪监测结果跟踪监测结果表明表明，接种接种10-14天后天后，仍可在样品中检测到该基因工程菌仍可在样品中检测到该基因工程菌。5二、BIOLOG技术技术*BIOLOG技术技术由美国由美国BIOLOG公司于公司于1989年研发成功年研发成功，最初根据各种细菌的初根据各种细菌的代谢指纹代谢指纹（metabolicfingerprint）来鉴来鉴定被分离纯化的微生物种群定被分离纯化的微生物种群，至今已能鉴定包括细菌至今已能鉴定包括细菌、酵母酵母和霉菌在内的和霉菌在内的2000多种环境微生物多种环境微生物。