梁鹏, 黄霞 2007 - 利用LIVE DEAD Baclight染色测定活性污泥中的活菌水平

第26卷2007年第5期9月环境化学ENVIRONMENTALCH￡MISTRYV01．26．N0．5Septen出ef2007利用I删DEADB剃ght染色测定活性污泥中的活菌水平‘粱鹏黄霞一(清华大学环境科学与工程系．环境模拟与污染控制国家重点联合实验室．北京，100084)摘要以uVE／DEADBacli甜n染色法测定活性污泥中的话苗水平，采用荧光染色剂sⅥDo9和碘化丙啶(PI)对活性污泥进行染色，并利用荧光分光光度计测量绿色荧光(F|，波长500—510nm)光强来表征活性污泥中活菌水平．该法直接对稀释后的污泥悬浊液进行测量，简化了测量步骤当污泥浓度小于100IIlg·l-1时，每毫升样品需投加染色剂25山；污泥浓度稀释到50m辱-l～，其惰性颗粒物对测量产生的影响在7％以下；超声波分散的最佳条件是：超声时阉2m．n，功率∞w．关键司活性污泥，BaeughI染色法，话苗，环境微生物中活菌测定的传统方法是通过对样品中的活菌培养后计数．由于部分微生物可培养性差(传统培养技术能分离培养的微生物只占环境微生物的otl％一l％⋯)，所测定的结果仅仅是可以培养的细菌．目前较为常见的活菌检溅方法主要基于活苗代谢特性(脱氢酶、醌、A1P、cTc染色等”1)和活菌特定组成结构(磷脂、PcR以及其它活菌染色技术”o)．由于活性污泥中含有不同种类的细菌，不同活菌的代谢能力可能不同，表征其代谢强度的脱氢酶和醌、ATP的含量也可能不同，所以通过细菌代谢能力不能准确地确定活性污泥中活菌水平．ⅡVE／DEADBadight染色原理是利用荧光染色剂与细胞核酸结合，使核酸在蓝光的激发下发射荧光，通过测定发射荧光的强度确定样品中活菌水平．所用核酸染色剂为sYT009和PI(碘化丙啶)与其它活菌检测方法相比，I』VE／DEADB”b出n染色法前处理简单，可使待测样品中的微生物基本保持原环境中的状态，测定时间短，在几分钟之内分辨出活菌和死菌，并可通过定量分析检测出活菌比例，且不受细菌种类的影响”J．本文以uVE／DEADBachght染色法，确定表征活性污泥中活菌水平的指标，然后确定染色剂投加量，针对污泥惰性颗粒提出最佳稀释污泥浓度和预处理措施．1实验部分确定表征活菌指标时采用纯菌(以E．coli为代表，包括活细菌和灭活后细菌)作为试验对象，以去除其它惰性颗粒对测量的干扰；确定活性污泥中染色剂投加量时，以实际活性污泥作为试验对象；针对污泥中惰性颗粒对测量产生的影响。以模拟活性污泥和等量的纯菌进行对比，以确定惰性颗粒对测量的影响程度．采用molecul盯p阳bes公司生产的UVE／DEADoBacli—“。”染色试剂盒(含SYToo9和PI)，将sYTOo9和PI两管染色剂分别用2．5“灭菌去离子水溶解，实验时等比例混合，将待测菌液与配好的染色剂按一定比例混合均匀后避光15min以保证染色均匀有效，利用日立F．2500型荧光分光光度计测定荧光强度．激发波长设定为470，m左右，测定5lOnm附近(绿光吸收波长)和630nm附近(红光吸收波长)的峰值，分别记为，。和，，，单位：cd，2结果与讨论2．1活菌水平表征指标的确定2006年10月30日收稿．·高等学校博士学科点专项科研基金(20020003041)资助项目．··通讯联系人，E．ud：“岫tg@劬咄峨educn万方数据5期粱鹏等：利用uVE／DEAD‰Hgllt染色测定活性污泥中的活菌水平599用纯菌EcD丘和灭活后的E∞“配置总菌量相同(0Dm=O．005)、括菌比例不同的溶液作为染色对象．以sYTOo9+PI(1：1混合)为染色剂进行染色，测定不同比例的活菌受激发后在不同波长下的荧光光强，结果如图1所示．样品受到激发后在500—5lOnm左右光强有一峰值．主要是SYlD09被激发后发射的绿色荧光，而染料PI被激发后发射的红色荧光(630nm附近)随活菌比例不同相差不大，不能准确表征死菌所占比例．进一步将图l中不同活菌比例的绿色荧光只和，l／(t+只)(按照Boul*等人提供的活菌比例计算方法”o)与活菌比例进行线性拟合：上瞪絮絮糕图1不同比例活菌在不同波长下的荧光强度鄹导1nu呲∞enceden8itiesd8l“铲删”ple诵t11diⅡj阳nIm6呻oflivebacte—a砒diⅡ；remwBvele“gt}．5P=425^+124‘／(‘+t)=o．0279月+o．8284式中，^表示活菌比例，萨表示直线拟合相关程度．冠2=o．9898R2：0．9314(1)(2)由公式(1)和(2)可以看出，对于两种染料共同染色后，绿色荧光光强与活菌比例呈良好的线性关系，f’／(‘+f)也和活菌比例呈线性关系，但其相关系数要小于绿色荧光光强和活菌比例之间的相关系数，这是由于红色荧光光强远小于绿色荧光光强．